常用的分子生物学内容和相关技术
一、分子克隆（分子操作）
大肠杆菌中1．原核表达系统（PET28a，PET30a
等）
融合蛋白抗原免疫动物
原核表达系统蛋白转导系统（TAT）
大肠杆菌中
2．真核表达系统（pcDNA3）：用于transfection（基因转染）
在培养的动物细胞中
分子克隆的方法：
●选择合适的表达载体
●选择酶切位点，设计PCR引物并合成
●制备待克隆的靶基因
☐PCR（来源培养细胞或组织、植物的mRNA cDNA）
☐RT-PCR
☐质粒中已克隆的目的片段
☐人工合成cDNA片段
退火后形成双链
二、细胞培养
☐动物细胞
☐植物细胞
☐原代细胞培养
☐传代细胞培养
三、探讨功能：
与细胞生长、增殖、凋亡的关系，检测mRNA、蛋白质的表达变化及意义
☐内源基因：或使内源基因表达抑制（RNAi,
down-regulation）或缺失、突变
☐外源基因：通过transfection（基因转染）、电转移、显微微注射等方法将外源基因导入培养的细胞中过
表达（overexpression），在mRNA、蛋白质水平上
表达上调（up-regulation）
☐信号传导：protein-protein interaction
◆Two hybrid system
◆Western blot
◆免疫荧光双标记图像分析
☐细胞:BrdU,Flow Cytometry（cell cycle，apoptosis）
☐动物：成瘤
四、检测表达
☐DNA:Reporter gene(promoter activity),Hybridization （DNA-Southern blot，RNA-Northern blot，tissues or cells-in situ）
☐RNA:RT-PCR，Real-time PCR,microRNA
Gene chips:cDNA,microRNAs
☐Proteins
（tissues or cells-Western blot or immunohistochemistry，serum or conditional medium–ELISA）。