测序技术
Ø 测序技术 • 大规模并行签名测序（Massively Parallel
Signature Sequencing, MPSS) • 聚合酶克隆（Polony Sequencing） • 454 焦磷酸测序 • Illumina (Solexa) sequencing
测序技术
Ø 自动测序法—
ü 嘌呤核苷酸降解可产生嘌呤碱，嘌呤碱最终分解为尿酸。 ü 嘧啶核苷酸的从头合成主要也在肝脏中进行。合成原料为
氨基甲酰磷酸及天门冬氨酸等。 ü 嘧啶核苷酸在体内的分解产物为CO2，β－丙氨酸及β－氨
基异丁酸等。
（二）脱氧核糖核酸（DNA）
Ø 定义：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ，DNA）是
脱氧核糖核酸（DNA）
Ø 功能：
ü 贮存决定物种所有蛋白质和RNA结构的全部遗传信息； ü 策划生物有次序地合成细胞和组织组分的时间和空间； ü 确定生物生命周期自始至终的活性和确定生物的个性。
Ø 复制：在双螺旋的DNA中，分子链是由互补的核苷酸配对组
成的，两条链依靠氢链结合在一起，A对T（由两个氢键相连） 或C对G（由三个氢链相连） 在DNA复制时也是采用这种互补配对的原则进行的：当DNA双 螺旋被展开时，每一条链都用作一个模板，通过互补的原则补 齐另外的一条链，即半保留复制。
半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的 模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将 待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR扩增
Ø PCR反应体系 PCR反应五要素
• 引物 • DNA聚合酶 • dNTP • 模板 • 缓冲液
PCR扩增
Ø PCR引物设计
• 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 • 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。ATGC最好随机分布。 • 引物内部不应出现互补序列。 • 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3′端的互
可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。
测序技术
Ø 鸟枪法
ü “鸟枪法”是一种由生物基因组提取目的基因的方法。 • 利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切
核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段， • 将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，
测序技术
Ø 测序原理 ü 化学修饰法：化学试剂处理末段DNA片段
，造成碱基的特异性切割，产生一组具有 各种不同长度的DNA链的反应混合物，经 凝胶电泳分离。 ü Sanger法：利用DNA聚合酶来延伸结合在 待定序列模板上的引物。直到掺入一种链 终止核苷酸为止。
测序技术
Ø 测序方法
• 生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核 苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种 残基上。
• 反式作用因子：能识别和结合特定的顺式作用元件，并影响基因转录 的一类RNA
二、DNA测序技术
Ø 定义：DNA测序（DNA sequencing）是指分析特定DNA片段的
碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C） 与鸟嘌呤的（G）排列方式。
Ø 目的：确定重组DNA的方向与结构，对突变进行定位和鉴定比
脱氧核糖核酸（DNA）
Ø 结构：DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’，5’-磷
酸二酯键相连构成的长链。 ü 一级结构：是指构成核酸的四种基本组成单位——脱氧核糖核苷酸
（核苷酸），通过3',5'－磷酸二酯键彼此连接起来的线形多聚体， 以及其基本单位－脱氧核糖核苷酸的排列顺序。 核酸的含氮碱基又可分为四类：腺嘌呤（AMP），鸟嘌呤（GMP ）、胞嘧啶（CMP）和胸腺嘧啶（TMP）。 ü 二级结构：是指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋 结构。 ü 三级结构：是指DNA中单链与双链、双链之间的相互作用形成的三 链或四链扭曲盘绕所形成的特定空间三级结构，也称为超螺旋结构 。DNA的超螺旋结构可分为正、负超螺旋两大类，并可互相转变。
测序技术
Ø 非同位素银染色法
• SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放 射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测 凝胶中的条带。
• 测序结果可以在同一天内得到 • 电泳完成后经90分钟就可读序。 • 用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊
修饰寡聚核苷酸的花费。 • 7-去氮dGTP（7-deaza dGTP，或dITP）替代dGTP
PCR利用DNA在95°高温时变性变成 单链，低温（经常是60°C左右）时引 物与单链按碱基互补配对的原则结合， 再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（ 72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到 五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
三、PCR扩增
Ø PCR扩增原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特 异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： • 模板DNA的变性 • 模板DNA与引物的退火（复性） • 引物的延伸 • 重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“
CTP及GTP ü 腺苷酸还是几种重要辅酶，如辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ、黄素腺嘌呤
二核苷酸(FAD）及辅酶A（CoA）的组成成分
核苷酸
Ø 代谢：
ü 嘌呤核苷酸核苷酸主要由一些简单的化合物合成而来，这 些前身物有天门冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、CO2及一碳 单位（甲酰基及次甲基，由四氢叶酸携带）等。主要是在 肝脏中合成，其次是在小肠粘膜及胸腺中合成。
核糖核酸（RNA）
Ø RNA转录 是指DNA的双链解开，使RNA聚合酶可依照DNA 上的碱基序列合成相对应之mRNA的过程。在人体 需要蛋白质时，mRNA将密码子带出核模外，到达 细胞质进行翻译（核糖体合成蛋白质的过程），合 成所需之蛋白质。因此，转录对不管是人类还是动 物甚至是细菌 都是不可或缺的重要反应。
核糖核酸（RNA）Ø Fra bibliotekNA翻译：游离在细胞质中的各种氨基 酸，以mRNA为模版合成具有一定氨基 酸顺序的蛋白质，这一过程叫翻译。
ü 氨基酸与tRNA结合生成氨酰-tRNA ü 多肽链的起始 ü 多肽链的延长 ü 多肽链的终止与释放
（四）基因
Ø 定义：基因（遗传因子，Gene）是具有遗传效 应的DNA片段（部分病毒如烟草花叶病毒、 HIV的遗传物质是RNA）。
较研究。
Ø 历史：
• 70年代末，WalterGilbert发明化学法、FrederickSanger发明双 脱氧终止法手动测序，同位素标记
• 80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）、荧光 代替同位素，计算机图象识别
• 90年代中期，测序仪改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳 • 2001年完成人类基因组框架图 • 2006年美国Illumina公司/2007年ABI公司SOLiD 测序仪
补重叠。 • 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%。 • 引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严
格要求配对，最佳选择是G和C。 • 引物的5′端可以修饰。
PCR扩增
Ø 模板的制备
ü PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 ü 模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病
分子生物学技术及其临床应用
张艳梅
2017-7-25
授课内容
Ø分子生物基础 ØDNA 测序技术 ØPCR 扩增技术 Ø基因杂交技术 Ø扩增片段分析 Ø基因芯片技术 Ø其他生物技术
一、分子生物学基础知识
（一）核苷酸
Ø 定义：一类由嘌呤碱或嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖以及磷酸三
种物质组成的化合物。
Ø 成分：戊糖与有机碱合成核苷，核苷与磷酸合成核苷酸，4种核
• 原核生物结构基因：连续的，RNA合成不需要剪接加工 • 真核生物结构基因：由外显子和内含子两部分组成
ü非结构基因：结构基因两侧的一段不编码的DNA片段（侧翼序 列），参与基因表达调控。
• 顺式作用原件：能影响基因表达，但不编码RNA和蛋白质的DNA序列
* 启动子 * 上游启动子元件 * 反应元件 * 增强子 * 沉默子 * Poly(A)加尾信号
位为四种核苷酸——腺嘌呤（AMP） 、 鸟嘌呤（GMP） 、胞嘧啶（CMP ）和 尿嘧啶（UMP） 。
核糖核酸（RNA）
Ø 分类
ü mRNA，又称信使RNA ü tRNA，又称转运RNA ü rRNA，又称核糖体RNA ü miRNA，MicroRNAs（miRNAs） ü 反义RNA(antisenseRNA）
苷酸组成核酸。
Ø 种类：根据糖的不同——核糖核苷酸及脱氧核苷酸两类
根据碱基不同——腺嘌呤核苷酸（腺苷酸，AMP） 鸟嘌呤核苷酸（鸟苷酸，GMP） 胞嘧啶核苷酸（胞苷酸， CMP） 尿嘧啶核苷酸（尿苷酸，UMP） 胸腺嘧啶核苷酸（胸苷酸，TMP） 次黄嘌呤核苷酸（肌苷酸，IMP）
核苷酸
Ø 分布：核苷酸是核酸的基本结构单位，人体内的核苷酸主要
一种生物大分子，可组成遗传指令，引导生物发育与生命机 能运作。主要功能是信息储存，其中包含的指令，是建构细 胞内其他的化合物，如蛋白质与核糖核酸所需。 带有蛋白质编码的DNA片段称为基因。
Ø 组成： DNA是一种长链聚合物，组
成单位为四种脱氧核苷酸——dAMP 、dTMP 、dCMP 和dGMP 。
有机体细胞自身合成。核苷酸在体内的分布广泛。细胞中主要 以5′-核苷酸形式存在。
Ø 功能：
ü 合成核糖核酸 (RNA—AMP、GMP、CMP和UMP） 脱氧核糖核酸(DNA—dAMP、dGMP、dCMP和dTMP）
ü 三磷酸腺苷 (ATP）在细胞能量代谢上起着极其重要的作用 ü ATP还可将高能磷酸键转移给UDP、CDP及GDP生成UTP 、