拟南芥培养方法的进展研究拟南芥( Arabidopsis thaliana) 是十字花科拟南芥属植物, 虽然没有经济价值, 但具有生育期短, 植株个体小及基因组小等特点, 因而长期以来一直被用来作为分子生物学和传统遗传学研究的模式实验材料, 作为高等植物中具有最少基因组的物种,在科学研究中的地位也是极为重要得。

为了与国际接轨, 近年来国内已引入了拟南芥作为实验材料。

室内培养不仅可以得到试验所需的材料,也可以打破自然条件的限制对拟南芥进行各种诱导,为拟南芥新品种的培养和种性的改良提供便利条件,掌握拟南芥室内培养技术对顺利开展植物发育生物学的研究具有重要的意义。

但是, 拟南芥属于较难培养的植物,许多因素制约着它的正常生长和发育，比如，拟南芥种子特别小, 幼苗很弱, 易夭折, 给它的培养带来一定的困难。

目前,国内很少有实验室具备国外人工气候室培养拟南芥的全方位调控条件, 在拟南芥培养方面存在成活率低、培养周期长等问题。

因此, 掌握拟南芥的培养技术非常重要。

拟南芥室内培养方法研究拟南芥室内培养一般从种子春化开始,经历消毒、育苗、移栽、后期管理、种子收集及保存等阶段。

通常采用水培和土培两种方法。

1种子的春化春化作用(verna lization)是某些高等植物具备成花能力所必需的,即通过适当长度和强度的冷处理诱导开花抑制蛋白基因沉默,从而使植物具备开花能力.近年来的研究已经表明春化过程中特定抑制蛋白表达沉默的原因部分是由于染色体上特定位点的组氨酸的共价修饰. 种子播前需在湿润条件下置4℃冰箱内低温处理3~4 d，对于已在冰箱内保存一个月以上的种子可不必低温处理。

2种子的消毒拟南芥种子的消毒主要是用次氯酸钠溶液和酒精，不同浓度的溶液对种子上的病毒和细菌有不同的杀灭作用，结合文献资料，在本人第二课堂的实验中（《拟南芥三种培养方法的比较》），对比了三种不同的消毒方法，探索消毒方法旨在寻找出一种对拟南芥种子伤害最小，并且最有效的消毒方法。

三种方法分别如下2.170%的酒精消毒处理5分钟，然后用2.6%的次氯酸钠溶液消毒处理10分钟2.275%的酒精消毒处理1分钟，1%的次氯酸钠溶液处理10分钟2.35%的次氯酸钠溶液消毒处理5分钟。

实验用品器材：培养皿，记号笔，封口膜，酒精棉，废液缸，移液枪（配枪头多个），EP管，酒精灯，镊子，吸水纸，玻璃棒，电热套，无菌操作台，高压湿热灭菌锅。

试剂：MS培养基原料(见附录)，次氯酸钠溶液，酒精（实验室的次氯酸钠溶液浓度为10%，酒精浓度为95%，消毒所用浓度均需自行配置），无菌水。

实验步骤1.配置MS培养基500ML,然后均匀分装到9个培养皿中。

2.将实验用品121摄氏度灭菌15分钟。

3.无菌操作台上进行种子的消毒工作。

取等量的拟南芥种子分别装入3个灭过菌的EP管中，做好标记，用移液器枪取1—1.2ML的消毒液注入EP管中对种子进行消毒。

终止消毒时间的方法是：在消毒时间快结束时，用移液枪将EP管内消毒液洗出绝大部分，然后注入无菌水，消毒既终止。

4.消毒后的种子用无菌水清洗5遍，最后一遍时保留无菌水。

5.用移液枪分别吸入一定量的种悬浮液注入培养皿中，摇匀使其均匀分布于培养基上，做好标记。

6.用吸水纸吸去培养皿内多余的水分。

7.用剪成约为2CM条状的封口膜将培养皿进行封口。

实验注意事项：1.灭菌时，移液枪、封口膜和记号笔不能用高压湿热灭菌锅进行灭菌，以免影响其功能，只需在紫外灭菌无菌操作台时，一并用紫外进行灭菌即可。

2.注入MS培养基的培养皿进行灭菌时，请务必在外面的报纸上标明上下方向。

3.灭菌结束取出物品时，切忌摇晃。

4.因为EP管的容量为1.5ml，所以每次消毒液取的不易过多或过少，以1—1.2ml为宜。

5.消毒过程中种子易沉在EP管底部，造成消毒的不充分，可用移液枪进行反复吸取和冲击，是种子悬浮起来。

不过种子从悬浮到静止沉淀需要部分时间，在计时时需注意把握。

可轻弹EP管壁帮助其加速沉淀。

6.用移液枪将消毒液吸出也需要部分时间，视操作员熟练程度而定时间长短，此过程中消毒一直在进行，在计时时要把握好。

7.为了保证清洗充分，每次用无菌水清洗的时间不得少于30s。

3育苗拟南芥的培养方法，在国内主要有土培，水培和培养基培养3种方法3．1土培法3.1.1土培基本法把营养土和蛭石按4: 6, 1: 2或1: 1的比例混合均匀, 预先放入通气良好的花盆内, 用自来水浇透, 待水完全渗入后15 min, 将经过春化处理的种子均匀地播在介质表面, 不盖土, 用塑料保鲜膜罩住花盆, 并在上面扎几个小孔, 薄膜既保证小苗所需要的湿度又保证了温度。

播种后3 d 就可以发芽, 发芽后, 及时把膜揭去, 发芽后发现表土干了可以浇水, 此时小苗比较脆弱, 浇水时, 最好用尖嘴洗瓶接近介质表面轻轻地浇, 以免把小苗冲倒, 不要浇得过多, 以免把小苗淹死, 把握少量多次的原则。

小苗长至3 cm 以上时, 每2 ~ 3 d 浇1 次水, 每次要浇透。

小苗长大以后, 需要间苗,最终每株小苗应占25 cm2 的面积。

3.1.2移栽法将种子按照MS 培养基法消毒后, 播在MS 培养基上, 置于4 ℃冰箱内春化4～5 d , 之后转入光照培养。

培养4 周后, 将小苗移栽到营养土和蛭石按体积比5: 5 混合的培养介质上, 用塑料保鲜膜将盆覆盖2 d 以缓苗, 之后的管理方法同土培法。

3.1.3蛭石培养法将种子直接播在蛭石中, 播种前用营养液将蛭石浸润, 然后将春化的种子播种在蛭石表面, 覆膜。

由于蛭石不含养分, 在培养时要浇MS 营养液。

具体管理方法同土培法, 但此法浇营养液的时间间隔要比土培法浇水的时间短, 原因是蛭石的保水性差些。

3.1.4沙培法取粗糙的河沙, 洗去沙中杂物, 将春化后的种子直接播于沙中, 用塑料保鲜膜将盆覆盖4 d, 以利于种子萌发和幼苗生长。

由于拟南芥种子小, 撒播时先将种子倒在质地较硬的纸上, 然后轻轻振动纸张便可均匀撒播。

由于蛭石也不含养分, 生育期内也要浇MS 营养液。

3.1.5三种基质培养法（第二课堂采用）将营养土，蛭石，珍珠岩按照4：1：2的比例配置培养基质，其它方法同土培法（如图）。

3.2水培法在本人第二课堂实验中，采用了一套简单易操作的水培装置（如图）。

水培的营养液为hoaglang培养液（见附录）。

3.3MS培养基法拟南芥种子消毒后用镊子或解剖针点播在灭菌的MS 固体培养基上, 避光, 春化后转到光照培养间, 鉴于拟南芥长大后可长之30cm左右，故可用锥形瓶盛放ms培养基。

以便于拟南芥的生长（如图）。

拟南芥室内培养技术的比较1. 有人曾将土培法、蛭石法、移栽法和基质培养法进行过比较实验认为移栽法种植的拟南芥在移栽后需要经过一定时间的缓苗期才能转入正常生长, 这使拟南芥成活率降低并且发育延迟。

在培养土中扎根浅, 导致其长势差; 另外, 移栽法种植拟南芥操作费工, 对实验有一定要求, 必须在前期培养其培养阶段完全避免污染。

蛭石培养法因蛭石不含养分, 必须在拟南芥全生育期内人工提供养分; 另外,浇水后蛭石变得黏重, 通透性变差, 易生真菌和藻类造成烂根和根系活力降低, 因此, 此法培养的拟南芥仍然成活率不高且苗弱影响到了后期的开花结果。

蛭石和营养土混合的使拟南芥成活率不高且苗弱。

土培法是目前国内许多实验室使用的方法, 该法的培养基质过分黏重, 通透性差, 易导致烂根及“烧苗”, 造成幼苗夭折; 而且此法培养的拟南芥苗期长势弱, 但其营养生长逐渐变旺盛, 生殖生长延缓, 生活周期过长, 不利于加快实验进程。

采用基质培养法所使用的培养介质, 既有拟南芥苗期根系生长所需的透水和透气性, 又能为后期生长持续提供养分, 且水、肥和气供应均衡一致, 因此拟南芥成活率高, 生长健壮, 生长发育进程快且整齐, 有关指标符合国际上拟南芥报道中的标准, 因此能最好地发挥拟南芥个体小和生育期短的优点。

因此认为,3种基质培养法可作为实验用拟南芥的简便易行且效果好的方法。

2.水培方法可以提供充足的营养和水分, 产生较大的更为整齐一致的植株, 而且可以避免其他培养方法中培养介质对根系生长的机械限制, 在适宜的光照、温度、养分等条件下, 尤其是相对于一些特殊的栽培要求来说, 可以排除栽培介质的干扰,培养出健壮的植株。

3.MS 培养基法最不同于其它六种几种方法, 此法培养的幼苗主要是生物技术实验或组织培养中提供外植体的需要, 不能用此方法繁育种子[ 参考文献][ 1 ]刘守伟, 刘士勇.拟南芥室内培养技术研究[J]山西大学学报(自然科学版)(2009)S1 0146 03[ 2 ] 张国增, 安国勇. 不同培养条件对拟南芥根细胞膜片钳记录的影响[J]. 植物学通报, 2005, 22(1): 27- 31.[ 3 ] 李俊华, 张艳春. 拟南芥室内培养技术[J]. 植物学通报, 2004,21(2): 201- 204.[ 4 ] 王秀荣, 沈宏. 严小龙. 拟南芥室内繁种技术研究[J]. 华南农业大学学报: 自然科学版, 2002, 23(3): 94.[ 5 ] Estelle MA, Somerville C R. Auxin- resistant mutant of Arabidoopsisthliana with an altered morphology[J]. Mol Gen Genet, 1987,206: 200- 206.[ 6 ] 殷奎德, 黄海. 拟南芥叶片超氧自由基的组织化学定位[J]. 生物学杂志, 2003, 20(2): 44- 41.。