上海博苑生物科技有限公司
优点与缺点
优点： 鉴定准确度更高，可以得到蛋白的序列 可以实现多个蛋白的鉴定 缺点： 增加了一步操作 算法更复杂，而且需要更多的操作经验
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蛋白的选择
一般以protein score C.I.%大于95或者单个肽段的 Total Ion C.I.%大于95作为蛋白成功的标准
对于一个样品点鉴定得到多个成功鉴定的结果， 以蛋白得分（ protein score ）最高的最为可信
一般而言，多个成功鉴定的不同蛋白之间相似性 也是非常高的，也可以通过难度 无法实现混合蛋白的鉴定
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二级质谱鉴定
质谱仪选择一级质谱中的一个峰，让这些峰所代 表的离子高速撞击质谱仪中的惰性气体，使其肽 键断裂，并对库搜索鉴定蛋白质
常用MALDI-TOF／TOF仪器进行
蛋白质质谱鉴定流程
样品
酶解
酶解片断
序列数据库
PMF 肽指纹图谱
一级质谱
成功鉴定
PSMs及后筛选
对库 检索
串联质谱
未知蛋白
De-novo 序列分析
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胰蛋白酶酶解
采用含乙腈的脱色液脱色至胶块变为白色 真空干燥仪中冷冻干燥 蛋白质组学级胰蛋白酶酶解过夜 采用含TFA和乙腈的溶液溶进行肽提取 真空干燥 采用含TFA和乙腈的溶液溶解样品并点样进
一般采用MALDI-TOF进行鉴定。因为MALDI质谱 图中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算
其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的 信息与实际测得的质量信息进行对比而实现鉴定
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优点与缺点
优点： 是用一级质谱鉴定蛋白质的经典方法，算法简单，
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串联质谱结果
——质谱图
二级质谱图
一级质谱图
从一级质谱图里 选出部分峰做二
级质谱
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蛋白点编号
串联质谱结果
——报告单
蛋白名称 蛋白GI号
理论分子量
蛋白得分
串联质谱离 子得分
串联质谱匹 配的序列
理论等电点 可信度
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CID on
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数据库检索
采用GPS Explore (V3.6 ，ABI) 软件进行分析 使用MASCOT（V2.1, Matrix Science, London, U.K）
搜库软件对本地数据库进行检索 检索数据库为NCBInr，切割的酶为trypsin ，允许最
行质谱测试
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质谱分析
ABI MALDI-TOF/TOF 4800 质谱仪 先用MS反射模式得到一级图谱 一级质谱激光总shots: 800次 选择5-10个母离子做MS/MS分析 二级MS/MS激光总shots: 2000次，碰撞能量1KV,
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蛋白信息查询
首先根据蛋白名称可以了解该蛋白的大致功能 使用该蛋白的GI号码可以到NCBI数据库进一
步查询该蛋白的信息 对于未知蛋白，可以采用BLAST或者其它功能
预测软件预测该蛋白的功能
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大的未被酶切位点数为1, 可变修饰为半胱氨酸乙酰 胺化和甲硫氨酸氧化，没有固定修饰，母离子质量 容差为50 ppm，片段离子质量容差为0.25Da
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肽指纹图谱（PMF）鉴定
PMF（Peptide Mass Fingerprinting）是根据一级质谱 （MS）所测酶解片段的精确分子质量鉴定蛋白质的 一种方法