5、蛋白质、核酸在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离原理 净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分 子进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其 亚基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子 中所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动 的速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质 的pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统 中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极 迁移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓 冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移， 称为阴极电泳。
2. 区带电泳
在一些惰性支持介质上进行电泳，电泳后不 同组分由于带电多少不同，移动距离不同，在支 持物上形成带状区间。 常见的惰性支持物有： 滤纸 称纸电泳 醋酸纤维素薄膜 薄膜电泳 淀粉、琼脂(糖)、聚丙烯酰胺凝胶 凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为支持 物的区带电泳。
3. 聚丙烯酰胺凝胶的形成与结构 *主要成分 单体：丙烯酰胺(Acr) 交联剂：N,N’- 甲叉双丙烯酰胺(Bis) 聚合反应 AP-TEMED催化体系： 过硫酸铵 (AP) 催化剂 四甲基乙二胺 (TEMED) 加速剂 *结构 三维网状结构的凝胶
生物化学实验
Biochemistry Experiment
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
（活性染色鉴定法）
RNA样品的消化（为下周实验做准备）
• 每2组取3支消化管，按下表操作
编号 试剂处理
1 （空白） 2（样品） 3（标准）
— — 1 2 1 — — 2 — 1 — 2
RNA样品液 /mL 标准磷原液 /mL 去离子水 /mL 5mol/LH2SO4 /mL
B液 30%凝胶贮液
2.5 mL
5 mL
去离子水 10%AP（最后加）
12.2 mL 300μL
3、灌胶液
沿玻璃板尽快加入两块玻璃板之间 的缝隙中，注意不要有气泡，当凝胶液 面距短板上缘0.3 cm时，立即轻轻将样 品槽模板插入凝胶溶液中，注意样品槽 中不要有气泡，凝胶溶液应充满样品槽 间隙。制胶装置室温垂直放置，30~60 min聚合反应完成。
加小漏斗，300℃加热沸腾10分钟，250℃左右继续 消化3～4小时至溶液透明，冷却，待用。
三、【操作步骤】
电泳装置
采用北京六一仪器厂的DYC型垂直板 电泳装置： 制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 每组（2人）做一块胶，两组共用一套 电泳装置，两套电泳槽共用一台电泳仪。
1、安装制胶装置
凝胶模由两块玻璃板（一块长板，一 块短板）和一个密封框组成，将它们按下 图组装，四周对齐，注意手指勿接触两块 玻璃板内侧的灌胶面，注意间隔条的安装。
注意：玻璃板（用海绵及洗洁精清洗）和梳子及 密封框一定要清洗干净。
不能 偷懒
垂直板电泳装置制胶装置组件
短板（凹形玻璃板） 长板（带间隔条玻板）
密封条（封胶条）
+ + NAD
乳 酸
氧 化 型 辅 酶
I
丙 酮 酸还 原 型 辅 酶 NhomakorabeaI
1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心 肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出5条区带，由阳极到 阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、 LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提 出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由H 和M亚基按不同比例组成的四聚体。
蛋白质在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素
电荷因素
分子大小 分子形状
• 电荷因素 • 分子大小 • 分子形状
蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
6. 聚丙烯酰胺凝胶电泳类型 （1）按电泳槽形式不同分 管状 垂直板型 ( 蛋白质、核酸分离 ) 水平板型 ( 核酸分离 )
(2) 酶活性染色法
利用该酶催化特定化学反应后，产 物直接与特定的染料反应，生成颜色而 显色，或再发生其它反应，最终生成有 色物显色。酶活染色法利用该酶活性显 色，所以专一性强，一种方法只适用于 一种酶蛋白，使其显色而其它蛋白并不 被显色。
(3) LDH同工酶活性染色法原理
用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色 液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的中 间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体，底物 脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的 不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下：
聚合反应过程AP-TMTED催化体系
★
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
★
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
•
★
Bis将单体长链间连成网状结构：
CH2=CH CH2=CH C=O
C=O
丙烯酰胺
NH CH2 NH C=O CH2=CH N, N’-甲叉
NH2
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH C=O NH2 C=O NH CH2 NH C=O C=O NH2
LDH同工酶亚基的聚合
LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中， 动物各组织中LDH同工酶各组分含量不同。临 床上对LDH及同工酶的检测可作为某些疾病诊 断的依据之一。
3、乳酸脱氢酶同工酶活性染色原理
(1) 电泳染色方法 不同物质染色方法不同，如核酸与蛋白质 不同，不同蛋白质之间也不同如糖蛋白与脂蛋 白，蛋白质染色方法很多： * 一般染色方法 是利用某些染料如氨基黑、考马斯亮蓝、 或银液与蛋白质结合形成黑色或蓝色条带，显 示出蛋白质区带位置，其专一性不强，凡系蛋 白质均可呈色。 * 特殊染色法 如针对糖蛋白或脂蛋白的染色法，针对不 同酶的活性染色法。
电泳进行中
一、【实验目的】
1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 原理和有关同工酶的知识。 2. 掌握连续系统聚丙烯酰胺凝胶电 泳分离乳酸脱氢酶同工酶及酶活性 染色的操作技术。
二、【实验原理】
（一）. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
1. 电泳定义和蛋白质电泳基本原理 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反 的电极移动的现象。 许多生物分子都可带电荷，如蛋白质、核酸 等，这些带电胶体颗粒在电场中均可移动。以蛋 白质为例，根据已学生化知识，蛋白质在小于或 大于其等电点的pH时，可带不同的净电荷，所以 也有电泳现象。不同蛋白质质点带电性质、带电 量多少、质点大小、形状都不同，决定了各自在 电场中移动速率和距离不相同，因而互相之间得 以分离。
移向负极
移向正极
蛋白质分子
COOH COO－ ＋ H+ ＋ NH3 NH3＋ － H+
蛋白质分子
COO－ COO－ －H+ NH3＋ 蛋白质分子 + NH ＋ ＋H
3
COO－ COO－ NH3＋ NH2
（总电荷：＋） pH＜pI
（总电荷：0） pH=pI
（总电荷：－） pH＞pI
不同pH条件下蛋白质分子在电场中运动状态示意图
（二）. PAGE分离乳酸脱氢酶(LDH)同工酶原理
1、同工酶概念 催化相同化学反应，但其酶蛋白的 结构、组成略有不同，表现出理化性质 和动力学性质不同的一组酶。 2、LDH同工酶催化的反应
COOH OH CH CH
LDH
pH8.8-9.8 pH7.4-7.8
COOH CH CH O + NADH + H +
凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔 径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小 和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上 大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分 离。在实际工作中，常依据待分离蛋白质已知相对分 子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混 合物得到最大限度的分离，大多数蛋白质在7.5%凝胶 中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准 胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶 来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。
注意：不能漏水
胶凝后用夹子将玻璃夹出
用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉
旋转180度，凹玻璃向里
将玻璃放进槽内
加缓冲液
5、 加样
小心将微量注射器伸入样品槽底部上方，不 要扎到凝胶，分别在每个加样槽内按下列 顺序和体积慢慢推入蓝色样品液(含蔗糖和少量 溴酚蓝)，使其沉降到底部形成集中窄的蓝带。 每位同学加四种，两边的槽不加。 心肌 脑 骨骼肌 肝 心肌 脑 骨骼肌 肝 5µ L 10µ L 5µ L 3µ L 5µ L 10µ L 5µ L 3µ L
几种常见的电泳槽
(2) 按制胶方式不同分 连续系统 只有一层 分离胶， 浓度均一。 不连续系统 制二层胶 分离胶 高浓度，浓度 均一。浓缩胶 低浓度
(3) 按分离原理不同分：
* 常规PAGE也称天然状态生物分子PAGE ， 即在电泳过程中，生物分子如蛋白质仍保持 天然构象、亚基之间的相互作用及生物学活 性。是根据被分离组分的电荷、大小和形状 三种因数综合效果进行分离。用于蛋白质、 核酸一般分离分析。 * SDS-PAGE 根据被分离物的分子量大小差 异进行分离，多用于测定蛋白质分子量。
式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)， m为溶液的终体积(mL)。 凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时， 凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使 用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用a:b在30左右，并 且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。
6、电泳
将电泳槽架放入电泳槽内，倒入其余 的电极缓冲液至正极槽(外槽)，按正负极 位置放上电泳槽盖，盖紧，并按正负极 连接上电泳仪。用稳压挡将电压调至80V， 待样品蓝带全部进胶后，调高电压至 150V，继续电泳，当指示剂溴酚蓝的蓝 带泳动至胶底部并出胶后半小时到40分 钟，关闭电源，停止电泳，前后共约2.53小时。