合同号：HY-XXXX 双萤光素酶报告基因检测
（miRNA靶基因验证）实验
和元生物技术（上海）有限公司，2013年4月21日
摘要：本实验使用双萤光素酶报告基因检测系统验证hsa-mir-21对目的基因Tropomyosin 1（TPM1）的抑制作用；通过检测带有TPM1的3’UTR的luciferase在hsa-mir-21过表达时的表达情况，同时结合带有突变预测结合位点的3’UTR的luciferase的表达，进一步确定了hsa-mir-21与TPM1靶基因3’UTR的作用位点。
关键词：hsa-mir-21，3’UTR，Tropomyosin 1（TPM1），Dual-Reporter Assay
1.实验原理:
萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。
单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。
Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。
得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于miRNA靶基因验证。
由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面，通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
2.实验目的:
验证hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR是否发生作用并进一步确定hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR的作用位点。
1.质粒与细胞株
pMIR-对照质粒（和元生物）；pMIR-TPM1-WT野生型3‘UTR实验质粒（和元生物）；pMIR-TPM1-MUT突变型3‘UTR实验质粒（和元生物）；pRL-CMV（E2261，Promega）；293T细胞株来源于ATCC，细胞培养条件为DMEM+10% FBS+5% CO2。
2.实验试剂
lipofectamine 2000（11668-019, invitrogen）; 胎牛血清(FBS)（SV30087.02，Hyclone）；DMEM（12800-017，GIBCO）；胰酶（Trypsin-EDTA）（11668-500，Invitrogen）；24孔板（3524，Corning）; miR-X mimics（和元生物）；Dual-Luciferase Reporter Assay System（E1910，Promega）；Opti-MEM（31985-062, invitrogen）。
3.仪器设备
荧光显微镜（IX71，奥林帕斯）；CO2培养箱（3111，Thermo）；生物安全柜（BSC -Ⅱ-A2，上海净化）；低速离心机（TDZ4-WS，上海湘仪）；血球计数板（REICHERT，Bright-Line）；
水浴锅（HWS12，上海一恒）；酶标仪（Infinite M1000，TECAN）
4.统计学处理
GraphPad Prism（Ver5，GraphPad Software）作图，并进行双侧t检验。
实验共分以下3个主要步骤：
1.质粒转染细胞；
2. 双报告基因检测；
3. 统计学分析。
1.质粒转染细胞：
(1)细胞铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。
(2)转染：16小时后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA，每个样品设置6个复孔
1)配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例为Firefly：
Renilla：转染试剂=0.1μg：0.01μg：0.25μl
2)配制RNA和转染试剂稀释液，RNA的终浓度为100nM，转染试
剂每孔0.25μL
3)稀释好的DNA和RNA及转染试剂，常温孵育5min
4)将稀释好的DNA和RNA分别和转染试剂混匀，常温孵育20min
5)每孔弃去50ul培养基，将25μL DNA转染混合液和25uL RNA转
染混合液分别添加到每孔细胞样品中，
6)转染6小时后，换新鲜完全培养基
2.双报告基因检测
(1)质粒共转染48小时后，弃去培养基，用100μl 1XPBS洗1遍
(2)倾斜96孔板，吸干剩余的PBS
(3)去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温
(4)每孔加50μl稀释好的1X PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂
解
(5)白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μl，加入100
μl预先混好的LAR II，2s后测数据
(6)每孔添加100μl预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数
据
注意：进行Luciferase活性检测时，需在避光条件下进行。
5.实验结果：
表1. 空白校准后的数据：
图1.hsa-mir-21与TPM1验证结果
**表示p<0.01
从图1的结果可以看到，hsa-mir-21可以调控带有TPM1的3‘UTR的luciferase的表达（p<0.01）。
在结合位点突变后，这种调控关系消失，由此证实了hsa-mir-21是通过该结合位点调控luciferase的表达。
6.参考文献：
Zhu S, Si ML, Wu H, Mo YY. MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem. 2007;282(19):14328-14336.。