50mL含有20mM的Tris-HCl（pH为7.2）的CZ1127岩藻多糖酶溶液，缓冲液，50mL 0.4％的岩藻依聚糖溶液和0.8 M氯化钠 石墨化碳黑 SPE柱(SUPELCO,USA) (Packer, Lawson,Jardine, & Redmond, 1998)，25％（体积/体积）乙腈，0.05％（体积/体积）的TFA和浓缩冷冻干燥机
• 通过在HMBC中从H-1至C-3的相关系数和在HMBC中从H-1至H-3的相关性可以确定3-联结
• HMBC谱 • 观察从残基B的H-1至残基A‘的C-3的相关性，观察从残基B的H-1至残基A的C-3的相关性，观察从残基C的H-1至残基B的C-3的相关性， 观察从残基D的H-1至残基C的C-3的相关性 • ROESY谱
• 低聚糖的分离和纯化
• 串联柱色谱四个主要部分I，II，III和IV，显着高RID信号，分配的回归系数为0.416，0.443，0.619和0.674，分离效 率为8.8%，8.3%，8.6%和7.6%，FACE进行鉴定其纯度，每个纯化的寡糖带很窄而明显，而且没有杂带，纯度很高 图片3.png
• 用了阴离子ESI-MS的低聚糖的鉴定
用酶水解海地瓜的低聚糖的制备
通过LC-MS测定低聚糖轮廓
• 高效液相色谱(Aglient 1260, Aglient Technologies, USA)- 串联四极杆质(Aglient.6400,Aglient.Technologies, USA)法，50 mM甲酸铵，紫外检测器(Aglient 1260,
背景
• SC FUC 的结构和他们有用的生物活性，如已确立了抗凝血性能和破骨细胞的抑制作用(Mul-loy et al., 1994) • 岩藻多糖的生物活性功能很大程度上取决于它的结构(Chandí a& Matsuhiro, 2008; Chevolot et al., 1999), • Sangwan, Tomar, Singh, Singh, and Ali (2011) 指出低聚半乳糖是和人乳低聚糖相同的和发展他们参与在两个消化和免疫系统 的健康地强劲的临床支持 • You, Yang, Lee, and Lee (2010) 报告了来自Undaira pinnatifida中天然岩藻依聚糖可以用作抗癌剂，且其转化为低聚糖后抗癌 活性显具增强 • 海参岩藻聚糖硫酸酯（SC-FUC），主要由岩藻糖和硫酸酯基组成的(Bordbar, Anwar, & Saari, 2011; Mulloy, Avles, Ana-Pau-la, Vieira, & Mourao, 1994), 是海参中的最重要的生物活性成分之一 • SC FUC对乙醇诱导大鼠胃溃疡有保护作用(Wang et al., 2012) • 一株海洋细菌CZ1127 FUCase和细胞内的酶能够解聚的海地瓜SC-FUC(Chang et al., 2010). • (Przybylski et al., 2010). Daniel et al. (2007)报道了从藻类岩藻依聚糖中通过电喷雾离子化伴有碰撞诱导解离串联质谱（ESICID-MS / MS）来得到硫酸化的单和二糖的分析 • Anastyuk et al. (2010) 阐明了用ESI-CID-MS / MS从藻类岩藻依聚糖中通过自动水解得到的低聚糖的结构性能。 • Yu et al. (2006) 使用的钠加合物和多电荷离子作为前体用ESI-CID-MS / MS对卡拉胶低聚糖的分析。
材料和方法 α 材料
材料
• • 2009 年 5 月从南中国海（福建，中国）收获的野生海参海地瓜，热空气干燥器SC-FUC (Chang et al., 2010)，研钵 木瓜蛋白酶和十六烷基吡啶氯化物，琼脂糖凝胶 Q 快速流(GE Healthcare, USA)
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在LC-MS，MS和色谱中所用试剂为HPLC级。在核磁共振实验中所用D 2 O的纯度为99.9％。其他试剂均为分析纯。
• 通过阴 ESI-CID-MS / MS的结构测定低聚糖
• 负离子ESI-MS和ESI-CID-MS / MS上进行一个Q-TOF质谱仪(Micromass Q-TOF Ultima Global,Waters, UK). 通过核磁共振结构测定低聚糖
• 1-dimensional 和 NMR谱和二维相关光谱（COSY），总相关光谱（TOCSY）异核单量子相干（HSQC），异核多键相关（HMBC） 和旋转架Overhauser效应光谱（ROESY）均在600兆赫
• 观察从残基B的H-1至残基A‘的H-3的相关性，从残基B的H-1至残基A的H-3的相关性，从残基C的H-1至残基B的H-3的相关性，从残基D 的H-1至残基C的H-3的相关性
• →在级分II中残基的序列为D1→3C1→3B1→3A / A0， C1→3B1→3A / A“， G1→3F1→3E1→3D1→3C1→3B1→3A / A‘， • H 1→3G1→3F1→3E1→3D1→3C1→3B1→3A /A'。 • 通过NMR验证 SI-CID-MS / MS的所有推导信息的结果→MC是一种是一个高效的且节省关于SC-FUC低聚糖结构上的调查的程序的样品， 且能够促进核磁共振光谱分辨率。 • 已经澄清了在SC-FUC的酶水解产物中四种主要的低聚糖的完好结构图片11.png • →组分II可以由组分I和一个非硫酸化的岩藻糖残基组成。组分III 能够由组分Ⅱ和组分Ⅰ构成，组分Ⅳ由2个组分Ⅱ的基团组成 • 硫酸化的三岩藻糖和硫酸化的四岩藻糖可能构成许多的海地瓜SC-FUC的结构骨干。
• ESI-CID-MS / MS提供关于低聚糖的结构测定的关键信息，如糖苷键的性质，部分序列和硫酸化残基的位置，然而还要核磁共振实验 揭示确定的结构 • 通过核磁共振低聚糖的结构测定α • 周围δ 1-1.5 ppm的化学位移在馏分的 谱Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ（补充图1）中的L-岩藻糖残基的甲基质子图片1.png(Pereira, • Mulloy, & Mourão, 1999).通过使用2维谱，包括COSY，TOCSY和HMQC，寡糖的其它质子和碳的信号在分配一维谱中图片9.png • 在所有纯化的馏分中 残基的H-1的化学位移均在4.58或4.59 ppm，且耦合常数都约为6.00赫兹→ A‘残基是β-异构体 • 其它残基的H-1的化学位移分别为在5.08-5.42 ppm，且耦合常数都约为3.60赫兹→除了A‘外所有的残基是α-异构体 • 谱的异构体信号的整合→残留A‘和残基A的相对数量为约2：1 • 岩藻糖残基在还原端的图案。可以得出结论A‘和A的还原末端残基有不同的异构体。
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• 低聚糖的分离和纯化
• 两个的Superdex肽列串联操作并使用相同的洗脱缓冲液以0.4毫升/分钟流速洗脱，反复进行净化Oonuki, Yoshida, Uchiyama, and Asari (2005)检查纯度（含 有36％的丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝胶在50mM Tris-甘氨酸缓冲（pH为8.3）中进行了标记的低聚糖的分离，在15mA的恒定电流，4℃下进行90分钟。检测 在365纳米上的反式照明器进行。
• O型硫化导致甲氧基质子的化学位移下降到0.4-0.8 ppm(Yamada, Yoshida, Sugiura, & Sugahara,1992).
• H-2和H-4的化学位移 残基B在组分I，残基C在组分II，残基C和残基F在组分III，在组分IV中残基D和残基G移动到0.63-0.79 ppm • →残基是2-O-硫酸化和4-O-硫酸化的。 • 用HMBC和ROESY确定糖基键和残留物的序列的图案图片10.png
• MS能根据其不同的分子量，灵敏地确定不同的低聚糖，SEC能根据其分子量的差异来分离样品，使用相同SEC树脂 后能很容易地按比例放大，并且每个特定样品的分布回归系数几乎恒定。 • SEC 和MS的组合将提供一个低聚糖的针对性分离的可行性方案。
• 通过负离子ESI-CID-MS / MS的低聚糖的结构测定 • 组分I ESI-CID-MS / MS实验糖苷碎片离子（B2 +钠在m / z473和C2 +钠在m / z491）指示非硫酸化的岩藻糖残基的存在。两个硫酸酯 基的位置是不明确的，糖类环绕 裂解为岩藻糖残基的3-联动的特性（Chen等，2008）两个连续 指示所有的糖苷键是3联的图片4.png • 组分II • 的位置是仍然不明确图片5.png • 组分III 离子 表明岩藻糖残基的组分III为3-联， 糖苷碎片离子 确定一个非硫酸化岩藻糖残基存在于它的末端和一个硫酸化 的岩藻糖残基是链接着它，糖苷碎片离子 表示的另外两个硫酸基团可能存在在两个岩藻糖残基的另一端上图片6.png • 组分IV 部分离子是和组分III的是相同的，除了一个糖苷碎片离子 藻糖残基图片7.png图片8.png 表明组分IV包括 组分Ⅲ和终点非硫酸化的岩 三个连续的 所有的糖苷键是3联的。糖苷碎片离子 反映存在两个连接非硫酸化的岩藻糖残基，但两硫酸盐基团
结果与讨论
• 低聚糖水解酶的制备 • CZ1127 藻酶的活性取决于 NaCl 浓度→ CZ1127 菌株受海洋环境的影响→妨碍了液相色谱—质谱检测并降低低聚糖 的分离效率 • 常用的脱盐方法费时或无效，脱盐用非多孔石墨化碳黑柱能够恢复SC-FUC低聚糖 • 由液相色谱- 质谱法测定低聚糖形 • LC-MS检测到八个低聚糖。单个低聚糖聚合的每度，三糖离子的电流强度和四糖均显着高于其他。酶促水解的寡糖 廓比酸水解简单 • 在酶促制备低聚糖时的回归系数彼此显著的不同，SEC可以有效地分离低聚糖图片1.png图片2.png
Q-TOF质谱仪(Micromass Q-TOF Ultima Global, Waters, UK).氮气，35伏特圆锥形电压,氩气,乙腈/110mM碳酸氢铵，1：1，体积/体积, D2O
通过核磁共振结构测定低聚糖
重水, D2O , Bruker AVANCE III 600 spectroscope (Bruker, German), 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulphonic acid