基因的构建程序基因组DNA的制备
为了最大限度地保证基因在度的断裂。制备的 DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段 的比率就越低，重组率和完备性也就越高
用常规方法制备的染色体
A
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DNA的长度一般在100库的质量标准
除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
一般来说，目的基因的克隆战略分为两利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然 后将之克隆表达。
A 鸟枪法
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性基因的基本概念基因的完备性
基因的完备性是指：在构建的基因中任一基因存在的概 率，它与基因最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中大小 / 生物基因组的大小 例如，人的单倍体D隆目的基因的基本战略
随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段，然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体DNA的切断
超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，
大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整
与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体
转化受体细胞
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作 为 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞
如果先将细胞固定在低融点凝
A
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胶中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段基因的构建程序基因组DNA的切割
用于基因组构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级 分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
鸟枪法操作的改进
凝胶DNA片段回收技术
冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片 段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳 性生物群落
Co物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因将DNA片段进行分级分离
例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼 脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于 1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此 凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进 行拼接
2.0 kb 1.6 k物基因组转录的部分或全 部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组， 贮存于受体ector、λ phage vector 、 P1 phage vector et.
第五章目的基因的克隆
目离目的基因的方法 E 化学合成法
基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和 生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。
筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
鸟枪法操作的改进
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率