1970年，美国麻省理工学院Khorana 等人首次报道了酵母丙氨酸转移核糖 核酸的全人工合成基因
H.G.Khorana（1922-）
一、DNA人工合成的原理
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利用人为操纵的化学反应，使核苷酸间形成正确联接 发展历史：H-亚磷酸酯→磷酸二酯法→磷酸三酯法→ 亚磷酸三酯法 固相亚磷酸三酯法：目前最通用的一种合成寡核苷酸的 方法，是在偶联于固相支持物上的连接臂末端通过逐个 加上核苷酸来实现的，其一个合成循环周期分为四个步 骤 ——去保护(deprotection) 、偶联（coupling）、封端 （capping）、氧化（oxidation）
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方法
扩增目的基因已知序 列下游3’端未知序列
oligo（dT）作为锚定 引物 用DNA末端转移酶， 在cDNA 3’ 末端加上 Poly（dA）尾 与此Poly（dA）相 对应的Poly（dT）作 为锚定引物
扩增目的基因已知序 列上游5’端未知序列
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第五章 目的基因克隆
第一节 PCR扩增法获 得目的基因
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本节要点
RT-PCR法 RT-PCR的步骤 三种不同引物引导的RT-PCR 已知基因N端部分序列RT-PCR 其它PCR法 反向PCR 锚定PCR 连接介导的PCR 盒式PCR RACE
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二、人工合成基因
基因的人工合成是在寡核苷酸化学合成的基础上建立的， 通常的策略是将需要合成的基因分成若干个相互重叠的片段， 先利用化学合成法分别合成这些小片段，然后让这些片段退火 配对，最后利用连接酶和聚合酶将这些片段连接成完整的基因 序列。
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经典3’RACE操作步骤
即锚定引物TTT(T)nIP-OP，含oligo（dT） 序列 、外侧引物区O P和内侧引物区IP
以mRNA为模板，用反转录引物合成3’端cDNA第 一链，在5’端引入了OP和IP序列 以基因特异引物GSP1和外侧引物OP进行第一轮 PCR扩增 以第一轮PCR扩增的产物为模板，以基因特异 引物GSP2和内侧引物IP进行第二轮PCR扩增 PCR产物进行直接测序或克隆于适当载体进行 序列分析
反向PCR原 理示意图
2. 锚定PCR
扩增对象
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1. 锚定PCR
根据已知序列设计的基因特异引物 也称之为单侧特异引物PCR（SSP-PCR）， 是根据已知目的基因的一小段序列信息来快速扩增已知 序列上游或下游片段的技术
引物
引物1 引物2 即锚定引物，根据序列的共同特征设计的非特 异性引物，非特异性引物所起的作用是在其中 一端附着。与锚定引物结合的序列称为锚定序 列。
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TTT(T)n-IP-OP:锚定引物 IP:内侧引物区 OP:外侧引物区 GSP:基因特异引物
经典3’RA CE 原理示 意图
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经典5’RACE操作步骤
以基因特异引物GSP1作为反转录引物产生cDNA 第一链 在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下，在cDNA 3’ 末端加上Poly（dC）（或Poly（dA））尾
容载(kb) 9-24 33-47 100-1000 75-100 50-350 100-300 70-200
稳定性 + + — + + + +
嵌合性 — — + — — — —
DNA 制备 易 易 难 易 易 易 易
植物转化能力 — — — — — — +
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BAC （Bacteial artificial chromosome）vector 细菌人工染色体载体结构
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连接介 导的PC R原理示 意图
4. 盒式PCR
方法
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在普通PCR过程中加入了一个 Cassette（盒）
人工合成的带有限制 性内切酶的粘性末端 的双链DNA分子
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特点
Cassette在设计时其5′末端没有磷酸基团
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mRNA

采用亲和层析法
oligo(dT)纤维素 柱分离纯化真核 mRNA
反转录
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将RNA反转录成cDNA第一链 反转录的引物 ：三种

基因特异引物（gene specific primer，GSP） 三种引物扩增特异性 多聚寡核苷酸引物（oligo (dT) primer）
3’端之间的未知序列 3’RACE
“十，根据锚定序列引入 方式的不同，RACE分为经典RACE和新RACE 经典RACE ：以锚定序列作为引物，3’RACE 中在反转录时引入第一链cDNA，5’RACE中在 合成第二链时引入第二链cDNA 新RACE ：锚定序列在反转录以前以寡聚核 苷酸RNA的形式连入mRNA中
方法
反向PCR 锚定PCR 连接介导的PCR 盒式PCR RACE
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1. 反向PCR
扩增对象
用于扩增已知目的基因序列侧翼的DNA片段
操作过程
酶切
连接环化 PCR扩增 测序分析
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RS:限制性内切酶酶切位点 GSP:基因特异引物
利用锚定引物（5’OP-IP-oligo（dG））（或 5’OP-IP-oligo（dT ））和基因特异引物GSP1进 行第一轮PCR扩增 以第一轮PCR反应的产物为模板，以基因特异 引物GSP2和内侧引物IP进行第二轮PCR扩增
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经典5’RACE 原理示意图
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● 一般流程
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● 一般流程
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●高分子量环境样品DNA的准备
对象细胞收集
细胞的低熔点Agarose凝胶包埋 （琼脂糖栓 Agarose plug） 细胞裂解、内切酶消化
脉冲场凝胶电泳
大片断DNA的回收与浓缩 （>100 kb）
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目的DNA片段的3′末端和Cassette的5′末端的 连接部位形成缺口
在第一次PCR的第一个循环，从Cassette引物 CP1开始的延伸反应在连接部位终止，限制了 引物 CP1和引物 CP1同一引物之间的扩增， 减少了非特异性PCR扩增
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CP:Cassette引物 GSP:基因特异引物 （正义引物） AGSP:基因特异引物 （反义引物）


高
随机六核苷酸引物（random hexamer primer）
低
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PCR扩增

以合成的cDNA单链为模板，采用基因特异引物进 行常规PCR扩增

过程： 上游引物与cDNA第一链退火，在DNA聚 合酶的作用下合成cDNA第二链
以cDNA第一链和第二链为模板， 用上、下游引物进行PCR扩增
盒式P CR原 理示 意图
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5. RACE
rapid-amplification of cDNA ends
5’端之间的未知序列 5’RACE
通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增，得到基因转录本的 未知序列，从而获得mRNA完整序列的方法
过程和分类
以mRNA为模板反转录成cDNA第一链 用PCR扩增出 cDNA内某一已知 序列位点到其
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2. 三种不同引物引导的RT-PCR
RNA 提取
反 转 录
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PCR 过程
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3. 已知基因N端部分序列RT-PCR
扩增对象
目的基因的DNA序列未知，但其编码蛋白的N端部 分氨基酸序列已知
扩增方法
新型5’RACE操作步骤
CIAP处理总 RNA, 使 rRNA 、 tRNA或 5’ 端不完整 无帽的mRNA去磷酸化脱掉5’磷酸基团 TAP处理全长的mRNA，去掉其帽子结构，保留 5’端的一个磷酸基团 设计锚定序列，具OP和IP区，用T4 RNA连接 酶，将具有锚定序列的一段短RNA寡核苷酸与 去掉帽子结构的mRNA进行连接 设计两条引物GSP1和GSP2，GSP1在GSP2的 外侧，以第三步中形成的杂合体为模板，利 用引物GSP1为反转录引物合成cDNA第一链 用GSP1和OP，GSP2和IP进行巢式PCR
根据氨基酸序列设计的简并引物和oligo（dT）进 行RT-PCR
根据密码子的简并性 设计的针对编码每个 氨基酸的所有碱基组 合的混合物
简并引物
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已知基 因N端 部分序 列RT-P CR示意 图
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二、其他PCR法
适用对象
获得的目的基因的DNA片段不完整，仅知道基因上 一小段序列信息时
DNA小片段→全长基因
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1、退火-连接法
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2、多步退火-延伸-连接法
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