a.载体的或考斯质粒；对于大型基 因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 上述几种载体的最大装载量如下： 质粒 15 kb λ-DNA 25 kb 考斯质粒 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb b.受体的选择： 根据载体的不同使用大肠杆菌或酵母菌
不同生物不同发育阶段，目的基因的转录水平 不同，因而在提取mRNA时，应选择特定发育阶段 的特定组织作为提取材料。 根据mRNA3‘端具有ploy(A)结构的特性，利用 结合了ploy(T)的纤维素柱层析法和磁珠分离法提取 mRNA，最后还可以利用琼脂糖凝胶电泳、密度梯 度离心等方法对进行富集。另外，有时还要大肠杆菌或其他受体混 合，使其转化进受体细胞内
cDNA 文 库 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部 克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重 组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落 原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则 采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA丰度低（<0.5%） 的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素 基因DNA，用物理方法或酶法，将DNA降解成预期大小的 片段，然后将这些片段与适当的载体连接，并转入受体 细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组 DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖 扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNNA序列。从基因组含 有生物生存、活动olyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏 感，分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因

三、目的基因的获得
（一）对已知序列基因的分离
1.核酸杂交法－菌落 和空斑的原位杂交 （P108、150）
2）特异分离程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收 目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度高(50～90%)的 目的基因克隆，如血红蛋白基因等
3）差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异 mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分 离克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新 基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之 后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因， 进而研究其生物学功能
目的基因获得的主要方法基因法 鸟枪法 cDNA法 化学合成法e bank）： 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以 克隆的形式存在DNA（含有全部蛋白质编码的结构基 因）
（3）基因组DNA与载体的连接 将基因组DNA片段与载体DNA片段用T4DNA 连接酶连接，然后重组体DNA与λ噬菌体外壳蛋白 在体外包装 （4）转化受体细胞 重组噬菌体感染细胞将重组DNA导入，重组 DNA在细胞内增殖并裂解宿主细胞，产生菌落原位杂交法、基因产物功能检测法
3） cDNA双链末端的处理

用上述方法合成的双链往往为平头末端， 要与载体分子连接，需进行一定的处理， 即使其变为粘性末端，一般多采用同聚物 加尾法和接头法等。
（4） cDNA与载体的连接
双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入 载体中： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是GC同聚物尾，这 样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插 入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收
基 因 组 文 库建过程中，最应引起重视 的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接！！！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施 的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在DNA片段的 末端上增补同聚尾末端
（3） cDNA克隆片段的获得
1） cDNA第一链的合成 2） cDNA第二条链的合成 自身引导合成法 置换合成法 PCR合成法 3） cDNA双链末端的处理
1） cDNA第一链的合成
2）cDNA第二条链的合成
a
2） cDNA第二条链的合成
b
2） cDNA第二条链的合成
c. PCR合成法（引物合成法）：不会丢失末的构建与目的基因的克隆


基因工程或DNA重组技术操作的前提条件是从生物 体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或 确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系 统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目 的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞 内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两用 PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因， 然后将之的方法，称为鸟枪法或散弹射击法，意味着从 含有众多的基因序列克隆群中去获取目的基因或序列。 当生物基因组比较小时，此法较易成功；工程量也很大。2. 基因组的构建程序 （1）载体和受体的选择
b.基因组DNA的切割 用于基因组构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制 性内切酶酶切两种方法，其目的是： 第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基 因断开， 大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分 离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
2.，分别从各孔中吸取少 量培养物，并将同一行和列孔中的培养物混合， 以此混合物为模板进行PCR扩增，最后根据凝 胶电泳的结果判定相应行或列混合孔中是否含 有阳性克隆。对含有阳性克隆的行或列孔中的 培养物再次分装培养板，并经培养后进行第二 轮PCR，如此反复操作，直到获得阳性克隆或 将气范，不同组织和细胞在 不同时段的mRNA 种类不同（即基因的过程
（1） cDNA克隆载体的选择
由于绝大多数真核生物的m对载体进行去磷酸化处理，可 防止载体自身环化，并保证重组分子的形成
（2） mRNA的提取与富集
例如，已知某目的基因位于 1.8 kb的SalI片段中，将染色体 DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳 分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝 胶块中回收DNA片段，景知 识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构（二）cDNA的构建 1. cDNA的定义：
以mRNA为模板，经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序 列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA。提取出组织细胞的 全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体 或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并 能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的c有一部分表达，而 且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表特异表达的因组DNA文 库所含的是带有DNA。
（2）基因组DNA的制备与切割
a.基因组DNA的制备 为了最大限度地保证 度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中 含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备 性也就越高 用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左 右；如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有 SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb 大所含克隆数N之间的关 系可用下式表示： N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文 库中克隆片段的平均大小为15大以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分 隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以 利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
4. 鸟枪法操作的改进
A.使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因 的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶 处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保 证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重 组子的出现频率，
B.在连接前将DNA片段进行 分级分离