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形成一个含
•Sau3AI和BamHI是 同尾的基因的获得
Producing representative genomic libraries in λ cloning vectors (1978年，最早用两种不 常见的酶酶切基因组，进行克隆。 )
第3章 目的基因的获得
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第3章 目的基因的获得
basic process of DNA recombination in vitro 体外DNA重组的基本步骤
1.目的基因的获得：从复离出带有目的基因的DNA片断。
2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断连接到能自我复制并带有选择性标
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第3章brary is prepared by reverse-transcribing a
population of mRNAs and then screened for particular clones. cDNA library：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录 产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个•A convenient simplification can be achieved by using a single restriction endonuclease that cuts frequently, such as Sau3AI. • Sau3AI and BamHI create the same cohesive ends.
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第3章 目的基因的获得
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第3章 目的基因的获得
Process constructing a 大片段的制备
物理切割法：超声波（300bp）或 机械搅拌（8kb）。 ② 酶切法：内切酶Sau3A进行局部消 化。可得到10-30kb的随机片段。
第3章 目的基因的获得基因组的大小• 一个理想的基因组，包含完整基因组的所有 DNA序列 • 理论上的克隆子数目＝基因组DNA总长度/DNA插入 片段的平均长度
• 实际的克隆子数目：大于理论
载体能够容载子越少。
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第3章 目的基因的获得
Process constructing 过反转录的方式合成cDNA
(i) isolate mRNA（提取总RNA并分离mRNA）; (ii)first-strand DNA synthesis on the mRNA template, carried out with a reverse transcriptase（用Oligo( dT)（或随机引物）作引物，以RNA为 模板，逆转录酶合成cDNA的第一链）; (iii) removal of the RNA template（去除RNA/DNA杂合链中的RNA，碱处 理或RNaseH处理）; (iV) second-strand DNA synthesis using the first DNA strand as a template, carried out with a DNA-dependent DNA polymerase, such as E. coli DNA polymerase I（以cDNA第一链为模板，用DNA依赖性的DNA聚合酶合 成cDNA第二链）.
基因组DNA的处理： • 用两种酶对基因组进行部分酶切； • EcoRI甲基化酶封闭EcoRI位点； • EcoRI连杆(linker)与平末端连接； • EcoRI酶切产生粘性末端； Λ 噬菌体置换型载体的处理： • Cos位点退火，载体成环； • 用EcoRI酶切产生1个大片段，2个小 片段； • 去掉小片段，保留大片段； 连接反应： • 大片段与基因组片段连接形成噬菌 体基因组的串联体； • 在cos位点酶切成噬菌体大小后包装 进噬菌体头部； 10 10 • 感染宿主并在宿主中增殖。
记（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上 （DNA重组过程，需要各种工具酶 的参与）
3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。 4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因） 5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物
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第3章 目的基因的获得
contents
Creation of a genomic DNA library using the phage-λ vector EMBL3A. (1983年，采用一种酶对基因组进行切 割。该克隆策略方便高效。) 11
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• In place of phage-λ derivatives, a number of higher-capacity cloning vectors such as cosmids, BACs, PACs and YACs are available for the construction of genomic libraries. The advantage of such vectors is that the average insert size is much larger than for λ replacement vectors. But such libraries are generally more difficult to prepare, and the larger inserts can be less than straightforward to work with. • 除了λ 噬菌体衍生载体之外，还有其他许多的高容量克隆载 体（如B
• An example is the enzyme Super-Script II, marketed by Life Technologies (Kotewicz et al. 1988). This enzyme can also carry out reverse transcription at temperatures of up to 50℃. (如： Life Technologies公司生产的改造后的 Super-ScriptII可以在50 ℃下进行反转录。 )
the entire starting population
某种生物的基因组的全部遗传信息切割成一定长度的DNA片段，再
通过克隆载体贮存在一个受体菌A，因而无发育时期及组
织器官特异性； 一个完全的基因组中包含着基因组DNA上的所有编码 区及非编码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文 库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列， 所以基因组可真实地显示基因组的全部结构信息。
DNA mRNA cDNA
转录
反/逆转录
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第3章 目的基因的获得
Character o； • 以mRNA为材料，反映的是该生物特定发育时期、特定组织(或器 官)在某种环境条件下的基因表达情况，有一定的时效性； • 只与编码序列有关，因此 不能反映内含子、启动子、终止子以 及与核糖体识别等的序列的结构和功能特征
3：噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖），得到cDNA 4：从cDNA中筛选目的重组子
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第3章 目的基因的获得
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第3章 目的基因的获得
How to isolate mRNA？
•利用mRNA都含有一段polyA 尾巴的特点，采用亲和层析 柱将mRNA从总RNA（rRNA、 tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。 •合成12－20个 dT 组成 oligo （dT）作为引物与 mRNA poly（A）尾巴杂交，用反转 录酶引导可合成cDNA第一链。
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第3章 目的基因的获得
现在常用的酶：天然的酶改造过以利于生产 全长cDNA
• Several companies produce engineered murine reverse transcriptases that lack RNase H activity, and these are more efficient in the production of full-length cDNAs. • （现在常用突变了的反转录酶（老鼠病毒来源的），它们缺乏 RNaseH活性，因此更有利于生产全长cDNA）
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第3章 目的基因的获得
2：cDNA与载体连接，形成重组载体
在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。
（通过接头形成粘性末端而连接） 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G， 成为粘性末端。（通过寡聚化形成粘性末端而连接）
注：刚合成的cDNA双链的末端几乎不可能正好是内切酶的酶切位点，因 此这里肯定不存在由粘性末端直接相连的例子。这一点与基因组DNA与载 体的相连有所区别。
（2）载体分别与得到的基因组DNA大 片段进行连接 直接连接、人工接头（adapter）或同聚物加尾。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端相同（二者是同尾酶）。 （3）重组载体r？同尾酶？（第2、 5章）
（4）筛选重组子
化学合成 法
构建基因 组DNA文 库筛选目 的基因
构建 cDNA文 库筛选目 的基因
聚合酶链 式式反应 (PCR)法
第3章 目的基因的获得
1 化学合成法
• 多用于合成短的DNA片段，如引物、DNA探针等。
DNA合成仪
第3libraries ：a collection of clones, representative of
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第3章 目的基因的获得
cDNA克隆中使用的反转录酶
AMV：来源于禽类的成髓细胞瘤病毒 MMLV：大肠杆菌中克隆的莫罗尼氏鼠白血病病毒
Native enzymes have poor processivity and intrinsic RNase activity,
which leads to degradation of the RNA template.天然来源的酶缺乏持续 合成能力，但具有内在的RNA酶活力，容易使RNA模板降解，不利于 生产全长的cDNA The native enzymes function optimally at 37℃ and therefore tend to stall at sequences that are rich in secondary structure, as often found in 5’ and 3 ’ untranslated regions.(天然来源的酶，发挥功能的最适温度是 37℃，且通常会在富含二级结构的序列出转录终止——这些结构往往出 现在5端或3端的非翻译区（这样就不容易形成全长cDNA）)