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• 向培养好的斜面培养物中注入3～5mL无菌水，洗 下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬 液，均匀滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放线 菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。 • 真空抽去沙土管中水分。 • 将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4～6℃)干燥 处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。 或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥 器内保存。 • 保藏时间2～10年。
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培养： 将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养 至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～ 37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。 保藏： 培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植 一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉 等，须1～3个月移植一次。 保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。 斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外 和污染造成损失。
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复苏方法： —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， —— 将安瓿管顶部烧热， —— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶 部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下， 敲下已开裂的安瓿管的顶端， —— 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌 吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。
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6、定期进行分离纯化 定期进行分离纯化，对相应指标进行检查，也是有效 防止菌种衰退的方法。
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二、菌种的复壮
侠义的复壮 ：菌种已经发生衰退后，再通过纯
种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中 找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种 原有典型性状的一种措施。
3 菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
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• 世界上国际知识产权组织承认的法定保藏机构有 28家。 Ex： 美国的标准菌种保藏所（ATCC） 美国农业部农业研究服务部（ARS） 英国国立标准菌种保藏所（NCTC） 我国：中国科学院微生物研究所的普通微 生物菌种保藏管理中心（CCGMC） 武汉大学的中国典型培养物保藏中心 （CCTCC）
第三章
菌种的衰退、复壮与保藏
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第一节
菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退
菌种衰退（degeneration）是指菌种经 过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作 用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。
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（一）菌种衰退的具体表现
1、菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件 下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少， 就表现为衰退。 2、生长速度缓慢，产孢子越来越小。 3、代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。 4、致病菌对宿主侵染能力下降。
石蜡油封藏法 • 措施：阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而
且又防止了水分挥发。
• 方法：液体石蜡150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高
压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水 分→倒入菌种管中（高出1cm） → 4℃保存。
• 适用：霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等 • 保藏期：1～2年，或更长
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二、微生物菌种保藏技术
原理：根据微生物的生理生化特性，人为地创造 条件，使孢子或菌体处于代谢不活泼，生长繁殖 受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般 可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状 态，干燥和低温等。
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•斜面保藏法 •穿刺保藏法 •石蜡油封藏法 •沙土管干燥保藏法
60目筛
弃去大颗粒及杂质 去除有机物
80目筛
去掉细沙
吸铁石
10％～20％的 盐酸浸泡24h 水洗至中性 烘干或晒干
土：取地面下40～60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎， 100目过筛,水洗至中性，烘干。
将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入 安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃湿热灭 菌30min。
5、对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵 抗能力的下降等。
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总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到 质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生 长优势，导致在群体中最后数量占优势。
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（二）菌种衰退的原因
1、基因突变 （1）有关基因发生负突变导致菌种衰退 菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。 （2）表型延迟造成菌种衰退 如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产 量较高，进行复筛时产量却下降了。
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砂土管干燥保藏法 • 措施：无营养，缺氧，干燥 • 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂 土管中→ 干燥→ 封口 → 5℃保藏 • 适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有 芽孢的细菌 • 保藏期：1~10年或更长
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沙土管制作
沙：
河沙 吸去铁质
广义的复壮 ：一种积极的措施，即在菌种的生
产性能尚未衰退前经常有意识地进行纯种分离 和生产性能的测定工作，使菌种地生产性能逐 步提高。
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复壮措施方法
• • • • 纯种分离法 寄主体内复壮法 淘汰法 遗传育种法
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1、纯种分离法
通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保 持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复 原菌株的典型性状。 “菌落纯”的水平——稀释平板法、涂布平板法、平板划线 法等方法获得单菌落。 “细胞纯”即“菌株纯”的水平——培养皿或凹玻片等作分 离室的方法、显微操纵器的纯种分离法。
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沙土管恢复培养
无菌条件下打开沙土管， 取部分沙土粒于适宜的斜 面培养基上，长出菌落后 再转接一次。或取沙土粒 于适宜的液体培养基中， 增殖培养后再转接斜面。
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真空冷冻干燥保藏法：
措施：低温、干燥，缺氧，保护剂 方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮→ 加入安醅管中→低温冻结（-25~-40℃）→ 抽真空→ 真空封口 → 4-5℃保藏 适用：各大类（不产孢子的丝状真菌除外） 保藏期：5~10年或更长 常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡 聚糖等高分子物质。
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3、不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重 要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、 通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不 仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖， 在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。
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（三）菌种衰退的防治
1、控制传代次数
即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低 限度，以减少自发突变的机率。
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2、创造良好的培养条件
1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复 突变细胞。 2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失。
（3）质粒脱落导致菌种衰退
质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多， 不少抗生素的合成是受质粒控制的。
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2、连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。 一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突 变）的几率越高； 另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞 数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
长期保藏——砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。
对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法。
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5、讲究菌种选育技术
在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使 单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力,避免表型延迟现象。同 时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯 度。
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4、遗传育种法
即把退化的菌种，重新进行遗传育种，从中再选出高 产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。
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第二节 菌种的保藏
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件
1 经长期保藏后菌种存活健在； 2 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改 变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。
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3、淘汰法
将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温 等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。 例如： 有人曾将“5406”的分生孢子在低温(－10～30℃)下处 理5～7d，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存 活个体中留下了未退化的健壮个体。
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菌种的准备可采用下列几种方法： • 刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀 后加入冻存管内； • 接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂 混合分装于冻存管内； • 将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔 器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约510毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护 剂混匀后加入冻存管内； • 在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌 种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。
•真空冷冻保藏法 •液氮保藏法 •悬滴保藏法 •低温保藏法 •麸皮保藏法
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