碱法提取小鼠总DNA及基因鉴定：
一、实验器材：加样枪（1ml、200ul、20ul、10ul）、枪头（大中小一套）、EP管（20ul、1.5ml、
10ml）、试管架、浮标、温度计、胶布、手套、记号笔、锥形瓶、称量匙、冰盒
二、实验试剂：A液、B液、引物、mix、双蒸水、三蒸水、琼脂糖、TBE（5x、1x、回收液）、
核苷酸染料、Marker
三、母液配置：
1.10M NaOH: NaOH 40g加双蒸水至90ml，待NaOH完全溶解冷却后定容至100ml
2.0.5M EDTA：EDTA.Na2盐18.61g, NaOH 1.5g, 加双蒸水至80ml,逐滴加入10M NaOH
至EDTA完全溶解后加双蒸水定容至100ml
3.1M TrisHCl（pH8.0）：Tris碱12.1g，加水至70ml，边搅拌边加入浓盐酸4ml，然后
边逐滴加入1M HCl边测PH值，直至PH升至8.0（+\-0.05），定容至100ml（pH=8.8
的TrisHCl中边加入浓盐酸边测PH值至PH=8.0（+\-0.05）为止）
四、实验步骤：
1.剪取鼠尾（约芝麻大小）储存于-20度冰箱（-20度冰箱，主要是防止DNA降解，4度不
行）
2.提取DNA：
1)配置工作液——20ml体系A液：50ul 10M NaOH 加双蒸水至20ml
8ul 0.5M EDTA
B液：800ul 1M TrisHCl（pH8.0）加双蒸水至20ml
2)加150ulA液（液体应完全浸没标本），95度水浴锅煮1.5h（将EP管插入浮标
中后用胶布缠好防止EP管在加热过程中爆开）
3)加150ulB液，混匀（上下颠倒3-5下）
4)12000r/min 4度离心5分钟（可储存于-20度冰箱）
3.PCR（冰上操作）：P1 0.5ul（P为AC3I，G为AAA）
1)配置PCR体系——15ul体系P2 0.5ul
Mix 7.5ul
三蒸水4.5ul
DNA 2ul
2)加2ul上述离心后的上清液至PCR体系，瞬离
3)PCR仪扩增，参数设定：预变性：94度——3min
变性：94度——30s
退火：55度——30s 30个循环
延伸：72度——24s
72度——5min
4度——∞
4.琼脂糖凝胶电泳：
1)制胶——2%琼脂糖凝胶配方：
总体积（ml）20 30 40 50 60 120
琼脂糖（g）0.4 0.6 0.8 1 1.2 2.4
TBE 1x（ml）20 30 40 50 60 120
Tris-base 13.6g
TBE 5x配方：硼酸 6.56g
EDTA 0.73g
双蒸水up to 250ml
Eg：50孔大胶的配置：琼脂糖2.4g 微波炉加热5min左右冷却至适温后
加染料7.5ul
TBE 1x 150ml（需考虑蒸发量）
2)加样——Marker 0.5ul，样品8ul（加样前吹打2次，从右向左加样）
3)电泳——150V，300mA，20min（加样孔在近负极侧）
5.成像分析：Image lab 新建核酸凝胶（第一项）最后一项滤光片拨至中间
放置凝胶运行保存图像编辑拍照保存
6.结果及分析：
1)AAA分子量为700+？
2)AC3I分子量为400+？
3)AAA型——只出现AAA一条带
AC3I型——只出现AC3I一条带
双阳型——两条带都出现
野生型——AAA型老鼠没出现AAA条带或AC3I型老鼠没出现AC3I条带
或双阳型两条带均未出现
4)出现浅带的原因？判定为阴性还是阳性？我觉得阴性更多。

可能是上
样量的问题，可能是剪尾太少，还有就是没跑好。

（上样量不够？）
5)出现双浅带的原因？原因类似吧（PCR扩增有问题？）
6)个别条带出现弥散或拖尾的原因？未混匀啦，加样时间太久，还没跑
就弥散啦等等（加样前未混匀？）
7.注意事项：
1)实验开始前，首先打开水浴锅进行加热，至95度时改为恒温，水浴锅中应
加双蒸水，至线上3cm左右，煮的过程中要随时观察温度及是否有EP管爆
开
2)切忌过早拔梳子
3)放置凝胶时需将胶倒过来放置（加样孔向机器内侧）。