微物学
Microbiology
生命科学学院
第2章 微生物的纯培养和
显微技术
小！ 微生物的基本特点：
在多数情况下都是利用微生物群体来研究其属性；微 生物 (菌株)一般是以群体形式进行繁衍、保存。
培养技术在微生物学研究中具有重要意义！
培养物(culture)： 在一定的人为条件下，培养、繁殖得到的微生物群体。
缺点：需专门设备，适合专业保藏机构。
冰箱保藏
一般推荐在-70℃低温冰箱中保存处于特殊生理状态 (如添加甘 油20%(v/v) 做保护剂)菌株。
也可以使用 -20～-30℃ 的普通冰箱，但是普通 冰箱的微小温度变化可能引起培养物的反复融化和 再结晶，对菌体造成强烈损伤，保藏效果远低于低 温冰箱。
冰箱保藏是使用更为普遍的菌种保藏方法。
火焰灼烧灭菌。
接种操作：在无菌箱或无菌室内的无菌环境下进行。无菌 箱或无菌室的空气在使用前通过紫外灯或化学药剂灭菌。
二 用固体培养基获得纯培养
培养基：
培养微生物 的营养物质
液体培养基 半固体培养基 固体培养基
琼脂
最早用来培养微生物的培养基是液体状态，固体培养技术 首先是由德国细菌学家柯赫建立。
柯赫助手W. Hesse与夫人
采用稀释平板方法会使一些 严格好氧菌被固定在琼脂中间因 缺乏氧气而影响生长。
因此更常用的纯种分离方法 是涂布平板法。
3 平板划线法(streak plate method)
平板划线方法是使用接种环，通过 无菌操作蘸取少量要分离材料，在平板 表面划线，微生物细胞数量随划线次数 的增加而减少。
如果划线适宜，分散后的微生物细 胞经过培养后，可以在平板表面得到单 个菌落。
一定 稀释 度的 含菌 材料
预先准备琼脂平 板，取一定稀释 度样品涂布均匀
细菌的菌落 一般只在平 板表面生长
使用较多的常
规方法，但有时涂 布不均匀！
如果含菌材料稀释得当，在 平板表面或内部就可能出现有一 个微生物细胞繁殖形成的分散单 个菌落纯培养物。
将含菌材料加到温度较高的 培养基中倒平板容易造成某些热 敏感菌的死亡。
单细胞分离对操作技术有比较高的 要求，多限于高度专业化的科学研究。
五 选择培养分离
当样本中某种微生物存在的数量与其它微生物相比较非常 少时，仅采用一般的平板稀释方法几乎不可能分离到该种微生 物，故需采用选择培养分离法。
选择培养分离是群落中数量占少数的微生物分离纯化方法。
根据分离微生物的特点，或抑制大多数微生物生长，或造 成有利于目的菌株的生长环境，培养后目的菌株在群落中数量 上升，再通过稀释方法获得纯培养。
液体培养基稀释法的缺点是只能分离混杂微生物群体中占 数量优势的种类。
采取显微分离技术从混杂群体中直接分离单个细胞或单个 个体，经过培养后获得微生物纯培养物，这项技术称为单细胞 (孢子)分离。
一般采用显微操作仪在显微镜下进行。
操作难度与细胞或个体的大小成反 比，较大的微生物如藻类、原生动物易 于操作，而细菌则较难。
一定 稀释 度的 含菌 材料
一定稀释度 样品与溶化 培养基混合
将与样品混合 后的培养基倒 入无菌培养皿
细菌菌落可能 出现在平板的 表面及其内部
操作比较麻烦 (50℃)，对于好氧 菌和热敏感菌的分 离效果不好！
2 涂布平板法(Spread plate method)
这个菌落可能
就是由一个微生物
细胞繁殖形成。
菌种保藏的任务，是避免菌种：1 衰退；2 污染；3 死亡。
中国普通微生物菌种保藏中心 (CGMCC)、中国典型培养物 保藏中心 (CCTCC)，及其美国典型菌种保藏中心(ATCC)等。 菌种保藏的基本原理：
根据菌种特性和保藏目的的不同，为菌种提供特定的保藏条 件, 如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等, 降低微生物代谢 强度和水平, 从而限制微生物生长和繁殖速度，使其处于半休眠 或完全休眠状态。
㈠ 传代保藏
方法：针对不同菌种，选择琼脂斜面、半固体琼脂柱、液 体培养基或者蒸馏水、缓冲液等在一定时间内接种。置于 4 ℃ 冰箱保藏，定时传代。
保藏时间由于菌种的不同而有很大差异，有些可以保藏数年， 有些菌种仅可保藏几周。
原理： 在4℃低温下，微生物代谢强度明显下降。
优点：适用于各种微生物，简便易行、易于观察，是进行 微生物保藏的基本方法。
稀释摇管培养法 (shake tube method)
将待分离的材料用这些试
管进行梯度稀释，试管迅速摇 动均匀，冷凝后，在琼脂柱表 面倾倒一层灭菌液体石蜡和固 体石蜡的混合物，将培养基与 空气隔开。
培养后在琼脂柱中央有厌 氧菌菌落形成。
三 用液体培养基分离纯培养
主要用于原生动物和藻类等较大个体微生物的纯化分离，采用 液体培养基分离纯培养的方法——稀释法。
划线法与平板法的比较
4 厌氧微生物的分离 分子氧对厌氧微生物有毒害作用，必须在无氧条件下生长。
厌氧罐：采用化 学方法清除容器
内的氧气
如果某种厌氧微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用 通常的方法制备平板，然后置于缺氧的密闭容器中培养。
用于分离严格厌氧菌：
先将一系列盛有无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂熔化后 冷却并保持在50℃左右。
显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析和记 录等一系列内容。
显微技术是进行微生物学研究的基础！ 实际上，正是由于显微技术和培养技术的建立，才使我 们得以认识丰富多彩的微生物世界，真正使微生物学研究发 展成为一门科学。
第1节 微生物的分离和纯培养
微生物通常是肉眼看不到的微小生物，从混杂的群体中 分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步。
冷冻时介质的保护作用可以显著减少细胞损伤。
甘油或二甲亚砜等可以透入细胞，通过降低强烈的脱水作用 而保护细胞；大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯 吡咯烷酮等虽不能透入细胞，但是可以通过与细胞表面的结合而 防止细胞膜冻伤，所以冷冻保藏菌种时加入保护剂可以提高培养 物存活率。
液氮保藏
一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。液氮保藏可以达到 -196℃，从适用范围、存活期限、性状稳定等方面来看，是微生物 保藏方法中比较理想的一种。
1882年，柯赫助手的妻 子F. Hesse 具有丰富的厨房 经验，听说荷兰用琼脂制作 果冻和果酱，就建议使用琼 脂作为凝固剂。
菌落(colony)： 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁
殖到一定程度，可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子 细胞生长群体。
众多菌落连成一片
菌苔(lawn) 当固体培养基表面上的众多菌落连成一片时，称为菌苔。
1887年，R. J. Petri 发明
Petri dish
试管、烧瓶、培养皿是最常用的微生物培养器具，在使用
前必须进行灭菌，使容器中不含任何生物。为了防止杂菌，试 管和烧瓶用塞子塞口，空气可以通过，但是空气中的微生物不 能进入。
最常用的灭菌方法： 高压蒸汽灭菌。有的玻璃器皿也可以采用高温干热灭
菌方法。
通常使用棉花塞，也可用塑料帽或硅胶塞等。
㈡ 接种
在无菌条件下，用接种环或接种针挑取微生物，把它 由一个培养器皿转接到另一个培养器皿中进行培养，是微 生物学研究中最常用的基本操作。
火焰附近 (酒精灯、煤气灯)进行，防止培养器皿被环 境中的其它微生物污染。
接种环 (针)：镍铬合金，易于迅速加热 和冷却。
混合培养物：含有多种微生物的培养物。 纯种培养物：只有一种微生物的培养物(pure culture)。
通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果，纯培 养技术是进行微生物学研究的基础！
小！ 微生物的基本特点：
微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行 微生物研究的另一项重要技术。
因为绝大多数微生物的个体都远远低于肉眼的观 察极限，形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行 观察和研究。
一 无菌技术
在分离、转接及培养纯培养物时，防止被其它微生物污 染， 自身也不污染操作环境的技术， 称为无菌技术 (aseptic technique)，是保证微生物学研究正常进行的关键。
㈠ 微生物培养的常用器具及其灭菌 常用的器具： 试管、烧瓶、培养皿等。
培养皿是由正反 2 个平面板互扣而成，可以防止空气中微 生物的污染。
接种物在液体培养基中进行顺序稀释，得到高度稀释效果，使 一只试管中分配不到一个微生物细胞。如果稀释后某个稀释度的大 多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管中可能就是 纯培养物。
稀释法进行液体培养基分离必须在同一个稀释度的许多平行试 管中，大多数 (一般应超过95%)表现为不生长。
四 单细胞(孢子)分离
即富集培养条件, 如温度、pH、紫外 线、高压、光照、氧气、营养等，环境条 件的选择可以考虑物理、化学、生物等各 个方面的因素。
仅适应于该条件的微生物旺盛生长
待分离微生物在群落中的数量大大增加
从自然界中分离到所需要的特定微生物
富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理 条件的不同组合形式，可满足从自然界选择特定微生物的需要。
富集培养 技术用途
根据微生物特殊要求，从自然界分离出特定微 生物种类。
分离培养在特定环境中生长的微生物
以对羟基 培养基变混 重复几次 苯甲酸为 浊说明大量 目的微生 唯一碳源 微生物生长 物占优势
例如：利用富集培养从土壤中分离能降解对羟基苯甲酸的微生物
七 微生物的保藏技术
通过分离纯化得到微生物纯培养，能够保持性状稳定是微生 物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
缺点：保藏时间短、传代频、易 退化、易污染、工作量大。
改良：例如硅胶塞取代棉塞，液 体石蜡封存。改良原则是降低培养物 代谢、防止培养基干燥。
㈡ 冷冻保藏
原理：微生物处于冷冻状态，代谢作用停止，可以达到保藏 目的。