蛋白质是29：1 核酸是19：1
( H2C CH)n
CO
NH2
H2C CH ( H2C CH)n H2C CH ( H2C CH)n
CO
CO
CO
CO
HN
NH2
HN
NH2
CH2
CH2
NH
NH
CO
H2C CH ( H2C CH)n
CO
CO H2C CH
NH2
16
实验原理
1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移 动，这种现象称为电泳。
加样缓冲液
巯基乙醇
断二硫键
SDS
断化学键
H3C
SO4Na 带负电荷
SDS：Pr=1.4:1
甘油
促沉
二硫键 盐键 疏水作用 氢键
溴酚兰
? Tris
19
实验原理
• 浓缩效应
pH6.8
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl- Cl-
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl- Cl-
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl-Cl-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
pH8.8
快慢离子的产生 高的电压梯度 Pr-运动加速
20
实验原理
• 浓缩效应
pH6.8
5%
Gly- Gly-
Gly- Gly- Gly- Gly-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子 (pI 5.97) 蛋白质离子
pH8.8
10%
Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl-Cl-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动 分子筛效应
24
实验原理
• 分子筛效应
lgMw lgMw=-bx+K
pH6.8
5%
pH8.8
10%
电泳迁移率
Pr Mw在11.7-165Kd
25
实验原理
蛋白质移动的距离
迁移率= 脱色后的胶长
染色前胶长 指示剂移动的距离
H2O 30%Acr-Bis
3.9ml 3.3ml
3.4ml 0.83ml
Buffer (含SDS) 10%APS
(1.5M Tris-Cl pH8.8) (1M Tris-Cl pH6.8)
2.6ml
0.68ml
200ml
100ml
TEMED
10ml
10ml
TOTAL
10ml
5ml
5
❖制备分离胶(下胶)
28
Marker 97 66
44
29
20 14
31
Tanon-1600数码凝胶图像分析系统
GIS 1D 图像分析软件(Ver. 4.00)
通电
加入电极缓冲 液pH 8.3
加入样品
浓缩胶 pH 6.8
开始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚 蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
分离胶 pH 8.8
11
Staking gel Separating gel
12
电流路径
负极 凝胶
正极
外槽
——
内槽
——
外槽
13
实验过程
5. 染色、脱色 A. 染色20分钟
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）
1
实验流程
配胶
配分离胶(下胶) 配浓缩胶(上胶)
样品制备
电泳（1.5~2h）
染色（20min）
脱色（30min~2h）
分析
3
实验过程
1.装配装置
BG-verMINI型迷你垂直电泳槽 (北京百晶)
4
实验过程
2.凝胶配制
*Acr有神经毒 性
下胶(分离胶)10% 上胶(浓缩胶)5%
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动 分子筛效应
23
实验原理
• 分子筛效应
pH6.8
5%
pH8.8
10%
Gly- Gly-Gly- Gly-Gly-Gly- Gly-Gly-GlyCl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl-Cl-
快慢离子的产生 高的电压梯度 Pr-运动加速 浓缩效应
21
22
实验原理
• 分子筛效应
pH6.8
5%
pH8.8
10%
Gly- Gly-
Gly-Gly-
Gly-Gly-
CGl-y- CGl-y-CGl-y- CGl-y-CGl-y-CGll-y- CGl-lyC-Gl-lCyl-G- ly-
主要离子
pH6.8
5%
pH8.8
10%
• 分子筛效应
26
染色前
实验原理
迁移率= “蛋白质移动的距离”
指示剂移动的距离
L1 X L3
L2 X L4
染色后
Lx
蛋白质的带在哪呢？
L1
L4
L3
L2
27
PageRuler Prestained Protein Ladder A prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at 10 and 70kDa.
H2C CH H2C CH H2C CH
*Acr有神经毒 性
H2C CH H2C CH
CO
CO
CO
CO
CO
CO H2C CH
H2C CH CO
HN CH2 NH
NH2
NH2
NH2
NH2
HN
CH2
NH
CO H2C CH
n决定了交联度
CO
H2C CH
( H2C CH)n
CO
NH2
与浓度一起决定孔径的大小
电荷 分子大小 分子形状
17
实验原理
• 浓缩效应
PH6.8
Pr-
Pr-
Pr-
Cl-
Cl- Gly- Cl-
Cl-
Cl-
Cl-Gly- Gly-
GlyCl- Gly- Cl- Gly-
Gly-
Cl-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
PH8.8
18
Pr为什么带负电
C N
氨基酸侧链
封水或饱和 正丁醇溶液
出现明显界面时， 分离胶凝聚完成 （ 10~20min）
倒出水或正丁醇， 并用加样枪/滤纸 吸干
加入分离胶溶 液 pH 8.8
✓ 封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。 ✓ 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
7
❖制备浓缩胶(浓缩胶)
插入样品梳
加入浓缩胶溶 液 pH 6.8
样梳需一次平稳插入,梳 口处不得有气泡,梳底需 水平。
分离胶 pH 8.8
8
样品处理
Sample buffer
1. SDS
2. - mercaptoethSanaoml ple buffer
3. bromophenol blue
4. Glycerol
金属浴(100℃)中15min
SH
SH
s s
9
❖上样及电泳
考马斯亮兰R250
B. 脱色30分钟至2小时
14
蛋白质的染色方法
• 氨基黑
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
• 考马斯亮兰R-250，G250
G250测定蛋白含量
• 银染
敏感度最高，常应用于蛋白质双向电泳
15
H2C CH CO NH2
H2C CH CO
HN
+
CH2 NH
聚合原理
过硫酸铵是催化剂
TEMED是加速剂