7.1.5.3 柱色谱操作技术
(一)样品溶解与进样方法
溶剂性质须适应所用固定相，大量样品溶液导入色谱柱后不 马上扩散，集中在柱头，不会在柱内展开。
(二)展开操作
样品上柱后，加入洗脱剂，使样品分离并收集目的产物。展 开操作有多种方式，实际使用中选择何种操作方式取决于样品性 质、所需产品纯度及产率等。
1903年 俄国植物学家茨维持(Цвет，Tswet) 在填充碳酸 钙柱中用以石油醚冲洗植物色素萃取物，得到各色区带。 1931年 氧化铝柱中胡萝卜素两种同分异构体的分离，表现出
极高的分辨率。
1950年代 气相色谱出现，色谱分离的仪器化 1960年代 高效液相色谱的发展，高效固定相填料获得突破进展
随着生物技术的发展，色谱分离已成为生物产品高度纯化 最有效的的方法之一。从多数生物产品纯化工艺来讲，色谱分 2离020/是10/1产7 品包装前的最后纯化工序。
小分子溶质可自由 进入凝胶颗粒内部 ，下移通道较大， 下移速率较慢。
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凝胶色谱分离原理示意图
凝胶色谱柱的总体积Vt分为3部分：
Vt VoVi Vm
(7-28)
Vo为凝胶颗粒之间空隙的总体积；Vi为凝胶颗粒内部空隙总体积；Vm为 凝胶颗粒基质本身所占体积。
溶质分子充满色谱柱的体积，也即洗脱容积为：
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(2) 色谱分离方法的选择
对于蛋白质、酶、核酸等生物大分子，由于它们分子 量大、易失活以及具有生物专一亲和性等特点，较多地 选用多糖基质(如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等)离子交换色 谱、疏水作用色谱、凝胶色谱和亲和色谱等。
对于生物小分子的代谢物，由于它们分子量小、结构 和性质比较稳定、操作条件不太苛刻，采用吸附、分配 和离子交换色谱进行分离较为适宜。其中，氨基酸、有 机酸、核苷酸等一些离子型化合物的生产多用离子交换 色谱分离；而抗生素、生物碱、萜类、色素等次级代谢 产物多采用吸附色谱或反相分配色谱分离。
色谱分离基本特点
(1)分离效率高 Hale Waihona Puke 所有分离纯化技术中最高的(不计电泳)。
若用理论塔板数来表示柱效率，每米柱长可达103～105块塔板。 通常色谱柱长一般只有几厘米至几十厘米。
(2)应用范围广 从极性到非极性、离子型到非离子型、小分
子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳 定的化合物，都可用色谱法分离。
7.1.5 柱色谱分离法
工业规模色谱大多采用柱色谱法。
7.1.5.1 柱色谱吸附剂
色谱所用吸附剂对分离性能密切相关。用于生物产品分 离的色谱柱应尽可能满足下述要求：
(1)分离能力强： (2)分离速度高； (3)处理能力大； (4)目的产物回收率高，生物活性损失小； (5)使用寿命长，可再生，要求可反复再生使用半年以 上； (6)成本较低，价格合理。
(三)检测器与流分收集器
蛋白质中的肽键和芳香族氨基酸分别在206－215nm以及280nm 处有很强的光吸收，生物大分子物质色谱分离中，常用紫外分光光 度计作为检测器，直接了解蛋白质的分离情况。
流分收集器是将底部流出的液体，每次按一定量分别收集的仪 器。以容量式和质量式较为方便实用。
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7.1.4 色谱分离的基本原理
色谱操作中，加入洗脱剂而 使各组分分层的操作称为展开 (Development)，洗脱时从柱中 流出的溶液称为洗脱液(Eluate) ，而展开后各组分的分布情况 称为色谱(Chromatography)。
组分对固定相的亲和力： 〇＞△。 随着洗脱剂加入，两组分将 逐渐分开，亲和力弱的 “△”分子移动快，先从色 谱中分离出来，亲和力强的 “〇”分子后从色谱柱中出 来。 2020/10/17
(五)亲和色谱(Affinity Chromatography，AFC) 生物体内许多大分子化合物具有与其结构相对应的
专一分子可逆结合的特性(亲和力)。 把与目的产物具有 特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则当含有 目的产物的混合物(流动相)流经此固定相时，即可把目 的产物从混合物中分离出来。
(1) 根据流动相的物态分类气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
(2)根据操作压力分类 低压色谱(＜0.5MPa)、中压色谱(0.5～
5MPa)和高压色谱(5～50MPa)。
(3)根据洗脱操作分类
根据洗脱时展开方式的不同，可分为洗脱展开法、前沿 分析法和置换展开法3种。
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7.1.3 生物工业中的色谱分离
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(一)无机基质吸附剂 1．硅胶(Silica Gel)
用作分离介质的硅胶是人工合成的多孔二氧化硅，其表面含 有很多硅羟基团，可以进行表面化学修饰(化学键合)或改性。 以自由硅羟基对各种键合反应最为重要。
2．活性炭
活性炭是憎水性吸附剂，适宜于从水溶液中吸附非极性物 质。 活性炭柱色谱分离样品上柱量大，分离效果好，来源较 易，价格便宜，适用于大量制备性的分离。但活性炭生产原料 不同，制备方法及规格不一，其吸附力不像氧化铝、硅胶那样 容易控制，因此应用不广。
色谱分离原理示意图
7.1.4.1 分配色谱
分配色谱利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中分 配系数不同而分离，相当于连续性的溶剂萃取。
被分离的混合物在流动相携带下通过固定相时，溶质在固 定相和流动相之间的平衡关系服从分配定律：
Kd
cs cm
(7-01)
cs、c m分别为溶质在固定相和流动相中的浓度，Kd为分配系数。
(7-14)
A－吸附剂，B－游离在液相中的溶质，A—B表示吸附剂与溶
质的结合方式。 Ka、Kd分别为吸附与洗脱常数。
对大多数化合物而言，Langmuir吸附等温曲线是应用最多的:
c(A-B)
acB 1bcB
(7-15)
双曲线(凸形线)
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7.1.4.3 凝胶色谱
凝胶色谱分离已成为一种通用的分离方法，在生物 大分子物质的制备与生产技术中被广泛应用。
5．聚乙烯醇
聚乙烯醇系Toyo Pearl是以交联聚乙烯醇为骨架的凝胶过滤介 质。 Toyo Pearl为多孔的三向网状结构，大分子链上含有丰富的 羟基，骨架为高亲水性。除广泛用于凝胶过滤外，还可进行化学 2改020/性10/1而7 得到含有多种官团的离子交换吸附剂及亲和吸附吸附剂。
7.1.5.2 柱色谱装置
2．前沿分析法
在前沿分析法中，样品溶液不是作为一部分进入色谱柱， 而是连续不断地输入色谱柱，样品溶液本身起流动相的作用。 当溶液通过固定相时，不同组分根据与固定相作用力强弱不同 ，产生不同的移动速率。
前沿分析不能将样品中每个组分都分离回收，而只能得到其 中作用力最弱的纯物质，一般不用于混合物的分离。但此法适 合于在产品的精制中除去痕量杂质。前沿分析法的一个显著特 点是分离过程中样品溶液本身就是流动相，组分的浓度不会像 洗脱展开中那样逐渐稀释。
第07章 色谱分离技术 目录
7.1 基本原理 7.2 分配色谱 7.3 凝胶过滤 7.4 离子交换 7.5 亲和色谱
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7.1 基本原理
7.1.1 概述
色谱机理：利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使
各组分以不同程度分布在固定相和流动相中。 当多组分混合物随 流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速 率移动，使之分离。
Ve VoKdVi
(7-29)
或
Kd
Ve Vo Vi
(7-30)
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。
Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。
对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。
当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决2020定/10/1了7 物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
色谱和电泳是目前最好的两种分离方法，其塔板数可达 百万数量级。但电泳法目前尚不能用于生产规模的分离与 纯化，因而色谱技术成为分离和纯化蛋白质、酶、核酸、 多糖等生物大分子物质的核心手段。
(1) 色谱分离的规模
根据一次进样量的多少，色谱分离规模可分为： ➢ 分析色谱：＜10mg ➢ 半制备色谱：10～50mg ➢ 制备色谱：0.1～10g ➢ 工业色谱：＞20g／d
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3．纤维素
纤维素是β-1，4键相连的D-葡萄糖(偶而有1，6键合)的线性聚 合物，具有很高的孔度和亲水性。机械强度比葡聚糖凝胶和琼脂 糖凝胶都好。它同样可以进行化学修饰，以满足不同的需要。 纤维素及其众多的衍生物已被广泛地用于蛋白质类物质的纯化。
4. 聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺与交联剂N，N’—甲叉双丙烯酰 胺共聚得到的。聚丙烯酰胺亲水性好，pH 1～10范围内稳定，不 为生物降解，在色谱分离中有广泛用途。它主要用于凝胶过滤法 和凝胶电泳法的生物大分子的分离中。
(3)选择性强 色谱分离有很强的选择性, 可通过多种途径
选择不同的操作参数，以适应各种不同样品的分离要求。
(4)高灵敏度的在线检测 (5)快速分离 高效细颗粒固定相载体和高压液相色谱分离
技术的采用，保证在高分离效率前提下的高分离速率，可以提 高单位时间的产量。
202(0/610)/1过7 程自动化操作
3．羟基磷灰石
羟基磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2， 与生物体有很好的相容性。
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(二)有机基质吸附剂
1．琼脂糖(Agarose)
琼脂糖是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合而成的链 状多糖，是生物大分子物质色谱分离操作最常用的基质之一。
用环氧氯丙烷使琼脂糖交联，可增强基质稳定性，调节交 联剂和琼脂糖的比例可控制凝胶珠体的孔度大小。