含配体溶液
洗下未结合的蛋白
收集目的蛋白
亲和层析过程
his- tag所用层析凝胶的基质
上连接了一个NTA （[=nitrilotriacetic acid]氮基 三乙酸），可以与Ni离子结合， 而Ni离子与融合蛋白的6Xhis 氨基酸之间产生如图的吸引力， 从而将带有his-tag组氨酸标签 的融合 蛋白与其它蛋白区分 开来。 从图中可以看到，组氨酸残基 红色五元咪唑环是蛋白与Ni离 子作用的关键。 因此带暴露的His-6的蛋白能 结合于固化Ni树脂，用适当缓 冲溶液冲洗去其他蛋白后，再 用可溶的竞争性螯合剂洗脱可 以回收靶蛋白。
白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶是 由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成， 其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行选择。 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性电泳和 变性电泳。
主要内容
1 透析 2 层析原理 3 凝胶过滤 4 离子交换层析 5 亲和层析 6 电泳
1透析
按照分子大
➢ 将作为固相成分的 不溶性基质，例如葡 聚糖凝胶、纤维素、 树脂等填充到柱子中， 用平衡液平衡。
➢ 然后加样品，再用 适当的溶剂洗脱。
➢ 样品中各种成分通 过柱子取决于与固相 成分的相互作用，最 后以不同速率被洗脱 出来，达到将各个成 分分离的目的。
1.2 凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋 白质分子量大小进行分 离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。
带有SO3－ 或COO－基团，通常以SO3－Na＋ 或COO－H＋ 形式出现的叫做阳离子交换基；
带有N＋（C2H5）基团通常以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做 阴离子交换基。
阳离子交换基
强酸性，聚苯乙烯树脂 弱酸性，羧甲基纤维素 弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂
阴离子交换基
强碱性，聚苯乙烯树脂 弱碱性，二乙氨乙基纤维素
加 样
阳 离 子 交 换 层 析 过 程
平 衡 液 洗
蛋白质
离子交 换树脂
高离子 强度洗 脱液洗
高离子 强度洗 脱液洗
收集
4 亲和层析
依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分 离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是 非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析 中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的 一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。
时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所
以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况 同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。
当pI < pH时，蛋白质带净负电荷；而当 pI > pH时，蛋 白质带净正电荷。
举一例子：
已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。
答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓 冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此 pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后 用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。
透析袋
小进行分离。
分离取决于 透析袋截留
浓缩的蛋白 混合样品
的分子量。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ透析液
开始透析
处于平衡状态
2 层析原理
层析也称之色谱，基本原理是分析样品作 为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分 与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通 过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品 中各个成分的目的。
层析因固相介质不同又分为离子交换层 析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。
电泳
❖ 电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分 离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要 在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样 的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是 淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚 丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH 被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样 它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷 的多少有关。
LOGO
精氨酸激酶(AK)的表达及其纯化
目录
1 2 3 4
研究背景 实验材料 实验方法 结果及分析
蛋白质的分离纯化
❖ 蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必 需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方 法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基 础上建立的。目标蛋白质的分离决不是一件轻而 易举的事情，因为要把它与性质、大小和结构十 分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难。有 些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低，这无疑 将增加获取足量蛋白质的难度。
单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤层析过程示意图
Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)
logMr
▲目标蛋白质的分离纯化程序主要包括: ⑴材料的选择； ⑵组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； ⑶蛋白质初步提纯； ⑷选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全 纯化； ⑸目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保 持它的生物活性。因此，在目标蛋白质的整个分离 纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使 用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧 烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。
Kav
蛋白质Mr=49,000
洗出 液中 的蛋 白质 浓度
未知 洗脱体积（mL）
G-200 G-100
logMr
球蛋白Mr“ 选择性曲线”
3 离子交换层析
如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带 正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行 样品的分离。
离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、 离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。
一、蛋白质是两性电解质 根据蛋白质的分子结构，很容易得出构成蛋白质
的两性解离的基础是氨基酸残基的侧链可解离的基团。 作为两性电解质，每种蛋白质都有其等电点(pI) ，
这与它所含的氨基酸种类和数量有关。 所有的蛋白质，不管它具有什么样的功能，都能
在细胞内起一定的缓冲作用。
1. 蛋白质的电泳分离 凝胶电泳是目前常用的一种生化方法。用于蛋
当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析 柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合 的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后 可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和 层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。
平衡液
混合蛋白样 品
带有配体的树脂 珠（或胶粒）