精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化生物学实验教学中心目录引言 (4)1实验材料、试剂、仪器 (7)2 实验方法 (9)2.1配制LB液体培养基 (9)2.2 活化菌种 (9)2.3 扩大培养 (9)2.4 IPTG诱导AK的表达 (9)2.5蛋白质提取 (9)2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (10)2.7 上样和洗脱 (10)2.8 SDS-PAGE电泳鉴定纯化程度 (10)3 结果与分析 (11)3.1层析谱图 (11)3.2 SDS-PAGE电泳带型分析 (12)总结 (13)参考文献 (14)精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化指导老师：摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。

重组有AK基因的E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml的卡纳霉素的LB培养基中培养。

当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时。

加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。

通过CM-Cellulose阳离子交换层析，SephacrylTM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电泳纯的精氨酸激酶。

关键词：精氨酸激酶表达与纯化Expression and Purification of Arginine KinaseAbstract：Arginine kinase（ATP：L-arginine phosphotransferase EC 2.7.3.3），plays an important role in cellular energy metabolism in invertebrate. E. coli Rosetta which2contains recombinant AK gene was grown in LB medium containing kanamycin (Final concentration: 25 μg/m L). When absorbance at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropyl β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the incubation was continued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, then the crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified by following three methods in turn: CM-Cellulose positive ion exchange chromatography, Sephacryl TM-100gel filtrate chromatography, and Q-Sepharose anion exchange chromatography. A purified AK was found to be homogenous by SDS poly -acrylaminde gel electrophoresis.Key words: arginine kinase expression and purification精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化3引言无脊椎动物的精氨酸激酶（Arginine kinase, AK）（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）类似于脊椎动物中的肌酸激酶（creatine kinase ，CK）（ATP:N-肌酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3），是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。

AK 在体内催化反应方程式如下：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。

虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK 在结构上表现出了非常大的多样性。

按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。

2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。

3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。

某些物种的精氨酸激酶的晶体结构已经被解析出来，AK是由一个小的α螺旋组成的N端结构域和一个大的C端结构域组成的，C端结构域与Glu合成酶的C端结构域相似，8股串起来的反平行β折叠被7个α螺旋所包绕[2]。

过渡态类似物的结合部位不在两个结构域之间，而是在C端结构域的内部[3]。

如下图所示[4]：4图1. 结合有过渡态类似物的AK的晶体结构我们已经克隆有精氨酸激酶基因的菌株，宿主菌含表达质粒pET28a, pET28a含：强启动子序列，两个lac操纵序列；精氨酸激酶基因，核糖体结合位点，多克隆位点，复制起点。

在工程菌株中，导入抗Kana青霉素的pET28a质粒，菌株中原有质粒产生阻遏蛋白，这种阻遏蛋白与pET28a的LacO操纵基因结合，阻止外源基因的表达。

当加入IPTG诱导时，IPTG与阻遏蛋白结合，解除了阻遏蛋白与pET28a操纵基因结合的抑制作用，使pET28a上面的外源基因能够顺利表达[5]。

IPTG是一种乳糖类似物，我们的主要目的是诱导表达并纯化精氨酸激酶，为后续研究其在蛋白质折叠和分子伴侣中的功能做准备亲和层析法依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。

配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。

但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。

当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。

特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。

所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯5化提高1000至10000倍。

电泳电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。

蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。

凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。

一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。

蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。

本实验我们做了以下工作：用含卡那霉素的LB液体培养基活化并扩大培养菌种，利用IPTG诱导精氨酸激酶（AK）的表达，经离心、超声波破壁获得AK粗提液。

粗提液用His-tag Ni 亲和层析纯化，用SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。

61实验材料、试剂、仪器1.1 材料工程菌种：E．coli工程菌株Rossta2.2 试剂LB培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，Nacl 10 g，溶于950ml水中，用NaOH 调节PH至7.0，加蒸馏水，定容总体积至1L，分装后高压蒸汽灭菌。

5×Binding Buffer : Tris(20 mM)，Nacl(500 mM)，加Hcl调PH至8.0，加蒸馏水定容至1L。

IPTG（1M）：称取2.3831gIPTG，定容到10ml无菌水。

12 %的分离胶（5 mL）:成分体积（mL）水 1.6030 %丙烯酰胺 2.001.5 M Tris (PH 8.8) 1.3010 % SDS 0.0510 % 过硫酸铵0.05TEMED 0.0027浓缩胶（2 mL）成分体积（mL）水 1.4030 %丙烯酰胺0.331.0 M Tris (PH 6.8) 0.2510 % SDS 0.0210 % 过硫酸铵0.02TEMED 0.002样品缓冲液：考马斯亮蓝R-2501.3主要实验仪器● 紫外分光光度计U－4300（Sweden/GE）● YC-1型层析实验冷柜（北京博医康实验仪器司）● CXG-1型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司）● ORION pH计（美国orion公司）● HD-3紫外检测仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）● TGL-16LA，GL-2M型冷冻离心机(湖南星科仪器有限公司）● GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司）● 超声破壁仪（上海之信仪器厂有限公司）● 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）● 超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司）● 低温恒温槽DH-2120（上海嘉鹏科技有限公司）●电泳仪DYY-5（北京市六一仪器厂）● 电子天平TE412-L，TE2101-L，CP64（德国Satorins公司）8● BS-1E振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂)● SW-CJ-1FD单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）● 3FG-01B电热恒温鼓风干燥箱● 高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）2 实验方法2.1配制LB液体培养基称取NaCl 1 g 、蛋白胨 1 g、酵母提取物0.5 g ，加入蒸馏水，配制成100 mL 的LB液体培养基，放入高压灭菌锅中灭菌。

2.2 活化菌种取50 µL表达菌种接入6 mL的LB液体培养基（含有卡那青霉素，其工作浓度为50 µg/mL）中，于37 ℃摇床振荡培养8-12小时。

2.3 扩大培养向100 mL LB液体培养基中加入100 uL 50mg/mL卡那霉素(工作浓度为50 ug/mL)，再加入6 mL活化的菌液，于37 ℃摇床中震荡培养2—3小时。

2.4 IPTG诱导AK的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时，加150 μl的IPTG至终浓度为0.2 mM时AK的表达量达到最大。