氨基酸的甲醛滴定
由于甲醛能与氨基酸中的由于甲醛能与氨基酸中的-NH2 作用形成作用形成NHCH2OH、-N(CH2OH)2 等羟甲基衍生物，使氨基 OH、 酸向解离出H 酸向解离出H＋ 的方向移动，表现为酸性增强，碱 性减弱（约2 性减弱（约2～3个pH单位）。 pH单位）。
五、氨基酸的化学反应
四、氨基酸的两性解离
酸 性 氨 基 酸 的 滴 定 曲 线
碱 性 氨 基 酸 的 滴 定 曲 线
Glu是酸性氨基酸,其解离形式为:
等电点时,Glu主要以两性离子(Glu±)存在, 〔 Glu+〕和〔 Glu-〕很小，且相等， Glu2-的量 可忽略不计。 故: pI=（pK1′+ pKR′）/2 =（2.19+4.25)/2 = 3.22
第三章 氨基酸
一、氨基酸的结构
共同特点： 1.除脯氨酸外，在α-C上皆有一个氨基； 2. 均为L-氨基酸； 3. 除甘氨酸外，均有手性碳。
二、 氨基酸的分类
修饰的氨基酸 (Modified amino acids)
三、氨基酸的一般物理性质
① 能结晶，晶形多种多样； ② 熔点高(＞200℃)； ③ 味道各异； ④ 除甘氨酸外，均有旋光性，蛋白质中的氨 基酸均为L－型，细菌中有D－型氨基酸； ⑤ 在近紫外光区(220nm-300nm)，只有Tyr、 Phe和Trp三种氨基酸有光吸收能力，最大 吸收值在280nm左右；
碱法
加6mol/LNaoH，密封于 ①能完全水解或不完全 6mol/LNaoH，密封于 小试管，置110℃ 小试管，置110℃水解若 水解, 水解, 干小时 ② Trp不被破坏, Trp不被破坏,
③ 水解液较清亮. 水解液较清亮.
酸法
加5Mol/LHCl,密封于小 5Mol/LHCl,密封于小 试管, 110℃ 试管,置110℃水解若干 小时
（2） 半胱氨酸的巯基：
a 和碘乙酸反应 b 和各种金属形成络合物； c 和Ellman‘试剂反应，用于-SH的定量测定； Ellman‘试剂反应，用于-SH的定量测定； d 巯基的氧化
（3） 胱氨酸的二硫键：
能被氧化剂(如过甲酸)及还原剂( 能被氧化剂(如过甲酸)及还原剂(如巯 基乙醇、二硫苏糖醇DTT)打开。 基乙醇、二硫苏糖醇DTT)打开。
阴离子交换树脂(含碱性基团），如：
-N(CH3)3OH (强碱性) -NH3OH (弱碱性) 可解离出OH－,溶液中的阴离子 能与其交换而结合在树脂上
分离氨基酸混合物常用强酸型阳离子交换树脂： 分离氨基酸混合物常用强酸型阳离子交换树脂：
用碱处理交换柱，树脂变成Na+型，调氨基酸混合物 至pH2-3，使氨基酸变成阳离子，与Na+交换而挂在树脂上。 结合牢固程度取决于： 静电引力 (主) 疏水相互作用 (次) pH3时，静电引力大小： 碱性AA(R2+) ＞中性AA(R+) ＞酸性AA(R0) 洗脱顺序： R0 (先) R+ (次) R2+ (后) 同时考虑疏水 作用影响： 疏水性较大的AA 与树脂的作用力＞ 疏水性较小的 AA与树脂的作用力
两种因素综合影响的洗脱顺序: 两种因素综合影响的洗脱顺序: Asp→Thr→Ser →Glu Asp→Thr→Ser →Glu → Pro → Gly →Ala →Cys →Val → Met →Ile → Leu →Tyr →Phe →Lys →His→Arg →Lys
氨基酸自动分析仪
蛋白质的水解
Lys是碱性氨基酸，其解离情况是： Lys是碱性氨基酸，其解离情况是：
依理可推得 pI=（ pI=（pK2′+ pKR′）/2 =（8.95+10.53）/2 8.95+10.53） = 9.74
Handerson-Hasselbalch公式： Handerson-Hasselbalch公式：
pH=pK′+ lg 〔质子受体〕 质子受体〕 〔质子供体〕 质子供体〕
有水，属分配层 析；若无水，则 属于吸附层析
薄层层 析
纸 层 柱 层 析 析
薄 层 层 析柱Leabharlann 层 析 示 意 图离子交换层析
以人工合成的高分子化合物( 以人工合成的高分子化合物(如苯乙烯－苯二乙烯 树脂) 树脂)做支持物，其上交联着可交换的阳离子或阴离子。 阳离子交换树脂(含酸性基团），如：
-SO3H (强酸型) -COOH (弱酸型) 可解离出H+，溶液中的阳离 子与其交换而结合在树脂上
备注
分配柱 层析柱中的填充 又称洗脱剂， 物(如硅胶、纤 为与水不互溶 依靠物质在两 层析 纸层析
维素) 维素)上吸附的 或微溶的有机 相中的分配系 水 溶剂 数不同而得以 彼此分开 支持物(滤纸) 支持物(滤纸)上 又称展开剂， 吸附的水 为与水不互溶 或微溶的有机 溶剂 若固定相上吸附 硅胶、氧化铝 同纸层析
水解方 法
操作
优点
缺点
①水解作用强烈, 水解作用强烈, 大部分氨基酸 被破坏, 被破坏, ②发生外消旋作 用 ① Trp被破坏, Trp被破坏, ②Asn.Gln脱去酰 Asn.Gln脱去酰 胺氨基, 胺氨基, ③水解液呈黑色. 水解液呈黑色. ① 水解不完全, 水解不完全, ②不宜用来制备 分离氨基酸。
1. 与茚三酮的反应 与茚三酮的反应
用纸层析、柱层析等方法把各种氨基酸分离 后，利用茚三酮可以对各种氨基酸进行定性定量 测定。
2.
氨基酸的α 氨基酸的α－氨基的反应
⑴ 亚硝酸反应
该方法的应用： a. 是Van Slyke法定量测定氨基酸含量的方法之一； b. 可用于测定蛋白质的水解程度；
（2）与酰化试剂反应 氨基酸的氨基与酰化试剂作用生成酰 胺衍生物。
分配层析： 1. 待分离的样品中的各组分彼此的分配系 数不同， 这是先决条件； 2. 分配系数大的组分沿流动相移动的速度 比分配系数小的组分快； 分配系数Kd＝ 分配系数Kd＝ C
C流动相
固定相
有效分配系数Keff＝ 有效分配系数Keff＝
C流动相×V流动相 C固定相×V固定相
层析技术
固定相
流动相
①能完全水解, 能完全水解, ②大部分氨基酸不被破 坏, ③不发生外消旋. 不发生外消旋.
酶法
用蛋白酶 酶解样品
①氨基酸不被破坏, 氨基酸不被破坏, ②不发生外消旋, 不发生外消旋, ③水解条件温和. 水解条件温和.
氨 基 酸 与 苯 异 硫 氰 酸 酯 的 反 应 该反应是多肽的氨基酸自动测序的基础， 又称Edman反应。
3. 4.
αα-羧基的反应 氨基和羧基共同参与的反应
5. R基参加的反应 R基参加的反应
（1） 酪氨酸的酚基和组氨酸的咪唑基: 酪氨酸的酚基和组氨酸的咪唑基:
Pauly反应 Pauly反应
六、氨基酸的分析和分离
氨基酸分析、分离的基本方法是各种层析 技术，包括柱层析、纸层析和薄层层析， 都是 基于氨基酸的酸碱性或极性的不同达到分离的 目的的。 各种分配层析技术的共同之处是都有两相： 固定相和流动相，两相互不相溶或溶解度很小。 各种氨基酸在两相中有各自特定的分配系数， 彼此因各不相同而在层析过程中得以彼此分开， 实现分离和分析的目的。差别越大越容易分开。
酰化试剂在多肽和蛋白质的人工合 成中用于对－NH2的保护。
（3） 烃基化反应
在弱碱条件下，烃基试剂发生亲核反应，取代了在弱碱条件下，烃基试剂发生亲核反应，取代了NH2的一个H。 的一个H
DNFB能与蛋白质或多肽的N-末端自由氨基 (-NH2)反应，水解后能得到与DNP相连的末端氨 基酸。结合薄层层析，可用于N-末端氨基酸的定 性鉴定。该反应又称为Sanger反应。