蛋白质前体的加工
• N端fMet或Met的切除 • 二硫键的形成 • 特定氨基酸的修饰 • 切除新生肽链中非功能片段 • 多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程 • 糖基化，磷酸化等等
蛋白质的分泌
不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋白质需定 位于细胞内的特异区域，或者分泌出细胞。分泌性蛋白 都有一段信号肽，即在蛋白质合成过程中N端有一15~36 个氨基酸残基的肽段---信号肽，它能引导蛋白质的肽链 到达并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切除。 相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分泌要简单得多。
一些信号肽的一级结构
蛋 白 的 分 泌 （ 一 ）
蛋白的分泌（二）
蛋 白 的 糖 基 化
革 兰 氏 阳 性 菌 蛋 白 的 分 泌
革 兰 氏 阴 性 菌 蛋 白 的 分 泌
伴侣蛋白
多肽链合成后必须正确地折叠才能具有天然的构象。经 过跨膜转运进入内质网的肽链，在折叠过程中是在蛋白伴 侣（chaperones)或称分子伴侣（molecular chaperones)辅助 下完成的，蛋白伴侣广泛分布于原核及真核细胞中。起到 介导各种功能域乃至整个蛋白质分子的折叠，辅助肽链折 叠成天然构象的具有生物学活性的蛋白质。
调节型强启动子
在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质表达 系统最基本的条件。
• 不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA，弱的 则相反。
• 外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有害，因为这一过 程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞的必要的生理功能。
• 带有表达克隆基因的质粒，在几次细胞分裂后往往会丢失。 • 解决的办法：引入强启动子并控制克隆基因在宿主细胞生长
融合蛋白作为抗原的标记蛋白
C-myc 标记蛋白
V5 标记蛋白
融合蛋白易于外源蛋白的纯化
Amylose树脂
MBP麦芽糖结合蛋白
目的蛋白
10 mM 麦芽糖
MBP
Factor Xa 蛋白酶切割位点
非融合蛋白的纯化
融合蛋白的纯化
原核生物表达系统
原核生物表达系统:大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌 大肠杆菌表达体系的优点： • 积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主菌和相应
mRNA的生物合成 (转录)
• 目的基因 • RNA聚合酶 • 启动子 • 转录终止信号 • 转录因子等等
-10区与-35区的最佳间距
-35区与-10区之间的距离大约是16~19bp，小于 15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。强启动 子-10和-35区之间的间隔为17±1 bp，增加或减少 都能明显影响启动子强度。
mRNA5`-------UAAGG -------AUUCCUCCA-------
大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3`-端的互补性
AUG前后的核酸序列
• DB 序列 5'-AUGAAUCACAAAGUG-3‘ DB 序列（ downstream box ）位于起始密码下游，16S rRNA 的1469-1483 碱基互补。这个序列也影响mRNA的起始翻译。
破坏终止子的功能。
茎环结构使转录终止的机理
RNA聚合酶
5
3
3
5
5´pppG
使RNA聚合酶变构，转录停止； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。
增强子
RNA聚合酶
修饰点 切离加尾
AATAAA
翻译起始点
外显子
转录起始点
内
含
TATA盒
子
转录终止点
CAAT盒
GC盒
蛋白质的生物合成（翻译）
mRNA起始翻译受下列因素影响 • mRNA的核糖体结合位点 • AUG前后的核酸序列
• 真核生物无SD序列，但是有一个Kozak序列，这个序列影响 真核mRNA的起始翻译。这个序列-3位的A最重要，而且在 +4位最好是嘌呤，G是最优的碱基。
-6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 G C C AC C AUGG
遗传密码与tRNA
除了极个别情况,遗传密 码在所有的有机体内是 相同的,但是不同的有机 体内不同密码子的使用 程度不同。而这种不同 是由于tRNA在不同的机 体内的丰度不同。
表达载体质粒
理想的表达载体质粒包括： • 一个具有3种不同的阅读框以方便基因插入的多克隆位点 • 一个调节型的强启动子 • 一个选择性标记 • 一个复制起点 • 一个有助于蛋白质的稳定、纯化并可去除的融合蛋白标签 • 一个转录终止信号 • 一个分泌信号肽（分泌型）
融合蛋白
融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连接 起来而编码的氨基酸序列。融合蛋白的作用： • 提高外源蛋白在表达系统中的稳定性 • 增加外源蛋白在表达系统中的表达量 • 增加目的蛋白的溶解性 • 作为抗原的标记蛋白 • 易于外源蛋白的纯化
mRNA的核糖体结合位点
SD序列(Shine-Dalgarno）UAAGGAGGU SD序列位于mRNA 5`末端非翻译的前导区内，其起点距翻译
起始密码AUG上游约3-11个 bp（-3— -11bp）。 SD序列与 16s rRNA3’末端碱基AUUCCUCC互补，控制翻译的起始。 二者互补的程度以及SD序列与起始密码间的合适距离(一般 是8个bp）都影响mRNA的翻译效果。
• mRNA的生物合成 • 蛋白质生物合成 • 原核生物表达系统 • 真核生物表达系统 • 蛋白质的纯化方法
遗 传 信 息 的 传 递 过 程
基因表达
转录 RNA
DNA
转录 mRNA 翻译
蛋白质
蛋白质生物合成的基本原理
参与蛋白质生物合成的物质包括: 1、三种RNA mRNA（messenger RNA） rRNA（ribosomal RNA） tRNA（transfer RNA） 2、20种氨基酸作为原料 3、酶及众多蛋白因子 4、ATP、GTP、无机离子等
周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时间。
转录终止信号
转录终止信号即终止子， 其作用是使RNA聚合酶 在DNA模板的特异位点 终止RNA的合成。
(DNA)3'-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAA-5' (RNA)5'-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU-OH-3‘ 通常只要有一个核苷酸的改变，破坏了规则的双螺旋的茎时，即可