植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定

一、实验原理
谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在
下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─
谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在
540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的
γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h
﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1
。

二、仪器与用具
冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、
1ml）。

三、试剂
1、提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，
0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，
0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl
调至pH8.0，最后定容至250ml；

2、反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L
谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795
gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子
水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；

3、反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入80mmol/L
盐酸羟胺，pH7.4；

4、显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g
TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定
容至100ml；

5、40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。
四、方法
1.粗酶液提取：称取植物材料1g于研钵中，加3ml提取缓冲液，置冰
浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g离心20min，上清液即为粗酶
液。

2.反应：1.6ml反应混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，
混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g
下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6ml反应混合液A的
为对照。

3.粗酶液中可溶性蛋白质测定：取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，
取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质。

4.原始数据记载
5.结果计算：GS活力(A·mg﹣1 protein·h﹣1)＝
式中 A—540nm处的吸光值；
P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）；
V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）；
T—反应时间（h）。