流感病毒的快速检测方法一、.................................................................. RT-PCR快速诊断方法
( 一) 生物安全要求
( 二) 病毒核酸提取
( 三) RT-PCR
( 四) PCR 产物纯化
( 五) 流感病毒RT-PCR检测引物二、........................................................ 免疫荧光方法检测流感病毒
( 一) 原理
( 二) 标本处理
( 三) 间接免疫荧光法
( 四) 结果判断
三、................. 实时荧光定量PCR( Real-Time PCR) 快速诊断检测
( 一) 基本原理
( 二) 实验试剂
( 三) 实验步骤四、............................................................................. 快速诊断试剂盒
流感的快速检测方法, 与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。
因此常见于流感暴发时早期病原学检测用。
流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。
这里介绍RT-PCR、
Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。
无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。
一、RT-PCR快速诊断方法
核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法, 即使基因组含量很低或死病毒也能够检测到。
本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应( PCR) 。
流感病毒的基因组是负链RNA, 在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA, 即为cDNA。
逆转录酶( RT) 就是用于合成cDNA的多聚酶, 因此, 扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。
RT-PCR需要一对型别特异引物, 四种脱氧核苷酸( dNTPs) , RNA模板, 逆转录酶及Taq DNA 多聚酶; 首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA, 然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环, 使DNA产物达到倍增的效果。
（一）生物安全要求
生物安全级别与个人防护要求: 生物安全二级实验室, 防护要求与二级实验室的要求相同。
并应遵守相应的生物安全规定。
进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时能够在生物安全二级实验室里进行, 核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
（二）病毒核酸提取
1. 实验材料及仪器
(1) QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit( Catalog# 74104)
(2) β-巯基乙醇( β-mercaptoethanol)
(3) 70% 乙醇
(4) 无菌1.5ml 离心管
(5) 10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头
(6) 可调14K微型离心机
(7) 旋转混合器
2. 操作步骤
(1) 取1支无菌、无RNA酶的1.5ml Eppendorf管, 加入500μl
RLT。
(2) 取采样液( 鼻拭子、咽拭子、胸水等) 或病毒培养物( 鸡
胚尿囊液或细胞培养液) 100μl, 加入上述Eppendorf管中。
(3) 加5μl β-巯基乙醇, 充分混匀。
(4) 加600μl 70%乙醇, 于旋转混合器混匀。
(5) 从试剂盒中取出带滤膜的离心柱, 并标上标本号。
(6) 将第4步的混合液体分两次( 每次600μl) 吸入于滤柱中, 1
rpm 离心15秒, 弃收集管中的离心液。
(7) 滤柱仍放回收集管上, 将第4步的混合液全部吸入滤柱中,
1 rpm 离心15秒, 弃收集管中液体。
(8) 于滤柱中加入700μl RW1, 1 rpm 离心15秒。
(9) 从试剂盒中取出一支新的2ml收集管, 将离心后的滤柱转
到新的收集管上, 于柱子中加入500μl RPE, 1 rpm 离心15
秒弃收集管中液体。
(10) 滤柱放回收集管上, 于滤柱中加入500μl RPE, 13000～
14000rpm 离心2分钟。
(11) 从试剂盒中取出一支1.5ml Eppendorf管, 将滤柱转到新的
1.5ml管上, 于滤柱中加入30～50μl 无RNA酶的水, 室温
静置1～3分钟。
(12) 1 rpm 离心1分钟, 弃滤柱。
收集的离心液即为提取病毒的
RNA, 能够直接用于逆转录实验, 或在-20℃以下保存,
-30℃可保存3～4个月。
3. 注意事项
(1) 试剂盒中的RPE液用前需加44ml无水乙醇, 使终体积达到
55ml。
(2) 所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。
（三）R T-PCR
1. 一步法RT-PCR
(1) 实验材料
1) QIAGEN One Step RT-PCR Kit Cat No 210212
2) RNase inhibitor 40u/μl( Promega)
3) 上游引物200ng/μl
4) 下游引物200ng/μl
5) 模板RNA( Templet RNA)
(2) 实验步骤
1) PCR反应配置( 在清洁区缓冲间, 加RNA模板应在核酸
室)
无RNA酶水( Rnase Free Water) 28.75μl
5×Buffer 10μl
10mM dNTP 2μl
Enzyme Mix 2μl
Rnase inhibitor 0.25μl
上游引物1μl
下游引物1μl
RNA 模板5μl
总量: 50μl
2) 将PCR 反应管放入PCR扩增仪
3) RT-PCR 反应条件: 此循环的反应条件仅共参考, 如果引
物更换, 相应的反应条件需要做适当调整。
→60℃ 1 min
→42℃10 min
→50℃30 min
→95℃15 min
→94℃30 sec
→52℃30 sec
→72℃ 1 min
→返回第5部, 循环34次
→72℃10 min
→4℃保存
4) PCR产物检测
琼脂糖凝胶配置: 用1×TBE 将琼脂糖配成 1.2%～1.5%溶液, 加热使之完全溶解。
冷却到50～60℃时加入溴化乙锭( Ethidium Bromide EB, 10ug/μl) , 终浓度为0.5μg/ml。
PCR产物检测: 将凝胶放入电泳槽,加入1×TBE Buffer , 使它淹没过胶面。
每份标本取4μl PCR产物, 与1μl 5×Loadin g Buffer 充分混匀后全加入凝胶孔中。
于同一凝胶的第一孔加入5μl分子量标准样品。
加完样后, 盖上电泳槽盖子, 接通电源, 稳压100v, 电泳时间约30～40min。
结果分析: 用UV～254暗箱式紫外透射仪观察电泳结果, 在透射波长254nm 下观察结果效果较好。
或者用凝胶成像系统观察电泳结果。
5) 注意事项: 含EB的琼脂糖经处理后放入科研垃圾袋内统
一处理。
含有EB的凝胶处理方法:
→加1倍体积的0.5mol/L KMnO4,小心混匀。
→加入1倍体积的2.5 mol/L HCl,小心混匀。
于室温放置数小时。