HPLC法
掌握HPLC法实验条件的选择
掌握HPLC法的定量分析方法
特点
1.适用范围广（可分析80%有机化合物）
2.分离性能好
3.分析速度快
4.灵敏度高
5.色谱柱可反复使用
6.流出组分容易收集
HPLC实验条件的选择
1. HPLC前处理
2. 色谱柱的选择
3. 流动相的选择
4. 洗脱方式的选择
5. 检测器的选择
HPLC前处理
1. 流动相的处理
溶剂的纯化
流动相脱气：除去流动相中的空气
方法：超声波振荡脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气、抽真空、加
热脱气、在线脱气系统
过滤 除去固体微粒；常用的滤头：亲水、亲脂、两用；0.45µm
色谱纯试剂 重蒸水
2. 样品的处理
除去杂质、纯化样品
浓缩样品或进行衍生化
过滤/高速离心
色谱柱的选择
根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度
用途：制备型、分析型
色谱柱的分类
正相色谱柱：固定相极性大于流动相，一般指硅胶柱，以正己烷系列为流动相。正相色谱法
主要用于分离分析能溶于有机溶剂的极性及中等极性分子型物质
反相色谱柱：固定相极性小于流动相，其技术就是在硅胶基质上键合有机碳链。
一般指C18、C8、苯基柱等，以甲醇、乙腈、水为流动相。 反相色谱法
适用于非极性及中等极性化合物
目前用的最多的色谱柱是反相键合相色谱柱
最常用：（octadecylsilane) ODS柱/C18 （十八烷基键合相）
键合相的优点
①使用过程不流失
②化学性能稳定，在PH2-8的溶液中不变质
③热稳定性好，一般在70℃以下稳定
④载样量比硅胶约大一个数量级
⑤适于作梯度洗脱
流动相的选择
对流动相的基本要求
①不与固定相发生化学反应
②对样品有适宜的溶解度
要求容量因子k在2～5 (最佳) 或1～10 (可用)
k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀
③必须与检测器相适应
例如用紫外检测器时避免末端吸收
④粘度小
（容量因子(capacity factory):也称为分配容量（partition volume）、
容量比（capacity ratio），是在达到分配平衡后，组分在固定相
中的量与流动相中的量之比。也称为质量分配系数。）
流动相的选择
反相键合相色谱
正相键合相色谱
反相离子对色谱
键合相色谱法：化学键合相为固定相的色谱法，分离机制以分配作用为主，对不封尾的键合相还有一定的吸附作用。应用最广泛的色谱法
反相键合相色谱流动相的选择
1.部分含水溶剂：水为基础溶剂，再加入可与水互溶的有机极性调节剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃）
适用于分离中等极性、弱极性药物
常用甲醇－水、乙腈－水系统
有机极性调节剂的性质及其与水的比例对保留值和分离选择性有影响
2.缓冲溶液 常用的缓冲液：三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液。
适用于可溶于水并具可解离特性的化合物，如蛋白质及弱酸、弱碱类化合物。
缓冲液及PH不同、及所占比例不同会影响组分的保留值
注意
由于C18链在水相环境中不易保持伸缩状态，故对于C18为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5％，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定
3.非水溶剂
流动相为不含水系统。
用于分离疏水性物质。
在乙腈及甲醇中加入二氯甲烷或四氢呋喃。这种色谱法称为非水反相色谱法。
正相键合相色谱流动相的选择
流动相采用饱和烷烃（如正己烷）中加入极性较大的溶剂为极性调节剂（如异丙醚），通过调节极性调节剂的浓度来改变溶剂强度。
反相离子对色谱流动相的选择
是极性较强的水系统混合溶剂
最常用的是甲醇－水、乙腈－水中加入0.003-0.01mol/L的离子对试剂
离子对试剂的性质、浓度、流动相的PH及流动相中有机溶剂的性质和比例都会影响组分的保留值和分离效果
洗脱方式的选择
等度洗脱 在一个分析周期内流动相的组成保持恒定
适合于组分数目较少、性质差别不大的样品
梯度洗脱
在一个分析周期中，程序控制流动相的组成改变（如溶剂的极性、离子强度、pH值等），使每个组分都在适宜的条件下获得分离。
适合于组分数目较多、组分间k值相差较大（10-100倍）的复杂混合物
梯度洗脱的特点
优点
缩短分析时间，提高分离度，改善峰形。使峰变尖锐，使微量组分容易被检出，提高检测灵敏度
缺点
常常会引起基线漂移，重现性较等度洗脱差
梯度洗脱需注意内容
1.要注意溶剂的互溶性，不相混容的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相
2.所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性
3.混合溶剂的粘度常随组成而变化
4.每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10-30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡
检测器的选择
1.紫外检测器（ultraviolet detector;UV)
2.荧光检测器（fluorophtometric detector;FD)
3.蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector; ELSD)
4.电化学检测器（electrochemical detector；ECD)
5.示差折光检测器（differential refractive index detector；DRID）
6.化学发光检测器（chemiluminescence detector;CLD)
7.质谱检测器(mass spectrometry detector;MSD)
紫外检测器（最普遍）
1.优点
灵敏度高，最低检出量可达10-7～10-12 g
不破坏样品，可用于制备
对温度及流动相波动不敏感，可用于梯度洗脱
2.缺点
只能检测具有紫外吸收或衍生物具有紫外吸收的 物质 流动相的截止波长必须小于检测波长
将被测溶剂装入1cm光径的吸收池，以空气为参比，改变照射波长，溶剂的吸收度A＝1时的波长称为截至波长
水;甲醇；乙腈：210nm;
3.种类
⑴可变波长紫外检测器（UVD）配制最多
⑵光电二极管阵列检测器 （photodiode array detector; PDAD或DAD）
光电二极管阵列检测器
特点
可以快速扫描被测组分的的紫外可见吸收光谱。可以同时获得样品的色谱图及每个组分的吸收光谱。
特殊功能
a、色谱峰的准确定性 b、峰纯度检验
c、多通道检测 d、峰抑制
e、宽谱带检测 f、选择最佳波长
a、色谱峰的准确定性
先取得该峰的光谱图,再与标准样品的光谱图进行比较,若两个光谱完全重合,说明是同一种物质;若不重合,说明是不同种物质。
b、峰纯度检验
在色谱分析中,通常利用吸收比确定峰的纯度。二极管阵列检测器既可使用吸收比的方法,又可使用比较光谱的方法。在峰的前沿、后沿和最大值处各取一点,扫出这三点的光谱图进行比较,若三个光谱图完全重合,说明是纯峰(只含一种物质) ,若不完全重合,说明峰中含有杂质。
(对于任何在紫外-可见光区有吸收的纯物质在两个选定波长下的吸收比为一常数，且与浓度无关)
d、峰抑制
如果两种化合物没有完全分离,但它们的光谱图有很大差别,就可以通过选择合适的测量波长、参考波长和带宽,使一种化合物被完全抑制 荧光检测器
1.优点
灵敏度极高，比紫外检测器高一个数量级
良好的选择性
线性范围较宽
受外界条件影响较小
只要选作流动相的溶剂不发荧光，荧光检测器就能用于梯度洗脱
高灵敏度和高选择性，适于体内药物分析
2.缺点
只适于检测能产生荧光或衍生物能产生荧光的物质。
应用不如紫外检测器广
流动相不能含有荧光物质或使荧光熄灭的物质
应用：氨基酸、多环芳烃、甾体化合物、酶
蒸发光散射检测器
色谱柱后流出液（流动相+组分）先引入已通气体（常用高纯氮或空气）的雾化器，流出物与通入的气体形成均匀的微小液滴，经过蒸发器（漂移管）加热，蒸发除去流动相，而样品组分在蒸发器内形成气溶胶，然后进入检测室。用强光或激光照射气溶胶而产生光散射（丁铎尔效应），用光电二级管检测散射光强度，从而获得组分的浓度信号。
散射光强度的对数与组分质量的对数成线性关系。
1.优点
通用型检测器。对各种物质几乎都有响应灵敏度比示差折光检测器高
流动相系统温度变化影响不敏感
可进行梯度洗脱
没有流动相的紫外吸收干扰
2.缺点 分析范围受样品组分和流动相挥发性的限制
流动相中如含缓冲溶液，缓冲溶液必须受到限制：必须是挥发性，并且浓度应尽可能低，不能用含缓冲盐的流动相。通常选用的缓冲溶液有：甲酸、乙酸、三氟乙酸等
是一种破坏型检测器，不能配备制备型的高效液相仪进行样品的纯化制备
比紫外检测器灵敏度低
3.在中药分析中的应用
中药的化学成分复杂，有一部分成分不存在紫外吸收或仅在紫外末端有吸收。紫外检测器难于检测。ELSD在某种程度弥补了这方面的不足
用于糖类、氨基酸、甾体等化合物
黄芪：黄芪甲苷，200.8nm末端紫外吸收
电化学检测器
电导检测器：用于离子色谱
极谱检测器
库仑检测器
伏安检测器 能氧化、还原的物质
安培检测器
检测限达10-12 g /ml，痕量组分分析
示差折光检测器
特点：
通用型检测器
对多数物质的灵敏度低（约10-5 g /ml），不能用于痕量分析
适合于糖类的检测（检测限可达10-8g /ml）
受环境温度、流动相组成等波动的影响大，不适合梯度洗脱