脑深部电刺激治疗帕金森病作用机制的探讨

王尔松，季耀东，胡锦，王晨，姚慧斌，呼建文，江澄川【摘要】目的从蛋白组学的角度探索脑深部电刺激（DBS）与毁损术治疗帕金森病的机制是否类同。方法采用荧光差异凝胶电泳（DIGE）技术，测定3例行双侧丘脑底核DBS治疗的帕金森病病人脑脊液中蛋白，在手术前（未干预组）、手术7d后但未刺激前（微毁损组）和刺激1周后（DBS组）的表达变化。另留取3例非中枢系统疾病病人的脑脊液蛋白作为正常对照组。结果未干预组和微毁损组、未干预组和DBS组、微毁损组和DBS组的组间比较分别发现14、18和13个明显差异蛋白点。除3个蛋白点外，未干预组和微毁损组与未干预组和DBS组的组间蛋白差异点完全不同；且在这3个相同的蛋白点中，两个蛋白点呈相反方向表达。结论结果初步提示DBS与毁损术治疗帕金森病的机制不相同。【关键词】帕金森病；脑深部电刺激；毁损术中图分类号：R742.5文献标志码：A文章编号：1009-122X（2012）03-0107-03StudyofmechanismsofdeepbrainstimulationforParkinson'sdiseaseWangErsong1,JiYaodong1,2,HuJin2,WangChen2,YaoHuibin1,HuJianwen3,JiangChengchuan1,21.DepartmentofNeurosurgery,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200540,China;2.DepartmentofNeurosurgery,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China;3.ResearchCenterforProteomeAnalysis,ShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200031,ChinaAbstract:ObjectiveTostudysimilaritiesanddifferencesinmechanismsbetweendeepbrainstimulation(DBS)andlesioningoperationforParkinson'sdisease(PD)fromtheperspectiveofproteomics.MethodsTheproteinsinthecerebrospinalfluidswereassayedbeforeoperation(noninterventiongroup),the7thdayafteroperationwithnostimulation(slightly-lesionedgroup),and1weekafterstimulation(DBSgroup)respectively,in3patientswithPDwhohadundergonebilateralsubthalamicnucleusDBS.Andthecerebrospinalfluidproteinstakenfrom3patientswithnon-centralnervoussystemdiseasesservedasnormalcontrolgroup.Two-dimensionaldifferencegelelectrophoresis(DIGE)techniquewasusedtodeterminetheproteinchange.ResultsTherewere14,18,and13significantlyalteredproteinspotsbetweennoninterventiongroupandslightly-lesionedgroup,noninterventiongroupandDBSgroup,slightly-lesionedgroupandDBSgrouprespectively.Withinthesealteredproteinspotsfromnonintervention/slightly-lesionedgroupsandnonintervention/DBSgroups,therewereonlythreeidenticalproteinspotsinpairedgroups,ofwhichtwowereregulatedindifferentways.ConclusionsOurpreliminaryresultssuggestthattheroleofDBSforPDisprobablydifferentfromthatoflesioning.Keywords:Parkinsondisease;deepbrainstimulation;lesioningoperation脑深部电刺激（deepbrainstimulation，DBS）因安全、可逆、效果好等优势，已逐步取代丘脑核团毁损术，成为外科治疗帕金森病的首选，但其作用机制目前仍不清楚[1]。在临床治疗过程中，DBS开启前常发生“微毁损效应”，其发生机制与毁损术相似。因此，监测微毁损后和DBS后有效指标可初步判断DBS治疗机制是否与毁损术类同。蛋白质浓度和结构的变化往往是疾病发生或治疗干预的结果，监测蛋白质可揭示疾病发生或治疗干预的内在机制[2-3]。因此，本研究采用荧光差异凝胶电泳（differencegelelectrophoresis，DIGE）技术，测定脑脊液中的蛋白在手术损伤（微毁损）后和DBS后的变化，初步探讨DBS治疗的可能机制，现报道如下。1对象与方法1.1研究对象收集复旦大学附属华山医院神经外科收治的3例行双侧丘脑底核DBS治疗帕金森病病人的脑脊液作为研究组，另取3例非中枢系统疾病病人的脑脊液作为正常对照组。两组病人的年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。1.2方法1.2.1DBS手术指征：参照Benabid[4]制定的筛选标准。先进行植入电极（Model3389，MedtronicInc，基金项目：上海市科委基金资助（编号：04dz14005；10140903500）；上海交通大学基金资助（编号：YG2010MS40）作者单位：200540上海，复旦大学附属金山医院神经外科（王尔松、季耀东、姚慧斌、江澄川）；200040上海，复旦大学附属华山医院神经外科（季耀东、胡锦、王晨、江澄川）；200031上海，中国科学院上海生命科学院蛋白质组研究分析中心（呼建文）通讯作者：江澄川，Email：

jiangcc1987@126.com·临床研究·中国微侵袭神经外科杂志2012年03月20日第17卷第3期ChinJMinimInvasiveNeurosurg,VOL.17,NO.3,March20,2012107··Minneapolis，USA），1周后植入脉冲发生器（KinetraModel7424，Medtronic，Minneapolis，USA）。术后第1天即开机。两组病人均局麻下腰椎穿刺，留取脑脊液3～5ml，经2000转/min，离心10min，－70℃冰箱保存。收集脑脊液标本征得学校伦理委员会的同意，参与者签署知情同意书。研究组按取样时间分3个亚组：未干预组（脑脊液取自术前）、微毁损组（脑脊液取自植入电极7d后但开机刺激前）、DBS组（脑脊液取自开机刺激1周后）。1.2.2DIGE检测方法：①蛋白沉淀：每个样品各取约400μg蛋白，丙酮沉淀，12000转/min离心10min，沉淀蛋白加入预冷丙酮清洗3遍，真空干燥后加入适量裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫尿，4%CHAPS，65mmol/LTris），裂解液和酶抑制剂以体积比50∶1混合复溶。②定量：使用Bradford法将蛋白分装成50μg1管，－80℃低温保存。③标记：把样品浓度均稀释到5μg/μL，将所有样品等量混合后分装作为内标。取样品和内标各50μg，调节pH至8.0~9.0，加入DIGE染料Cy2、Cy3、Cy5各1μL标记30min（冰上，避光）。标记结束后，加10mmol/L赖氨酸1μL终止反应10min。④双向电泳：将上述3个标记好的样品混合、等电聚焦。第一相进行等电聚焦（EttanIPGphorIsoelectricFocusingSystem，GEAmersham公司）为pH3~10，13cm非线性胶条；电泳条件：30V12h，500V1h，1000V1h，8000V8h，500V4h。第二相十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（HoferSE600，GEAmersham公司）胶浓度12.5%T，电泳起始电流为15mA/胶，20min后改为30mA/胶，至溴酚蓝离胶下沿0.5cm时结束。注意始终避光。⑤扫描：使用Typhoon扫描仪，分别用3种不同波长488nm（Cy2），532nm（Cy3），633nm（Cy5）扫描，获得图谱。⑥结果分析：采用图谱分析软件Decyderv6.5（GEhealthycare公司），选择蛋白差异点标准：蛋白点在6块分析胶中均有显现；两组比较选择t检验，P＜0.05；平均数比率＞1.5或平均数比率＜－1.5。1.3临床治疗效果分析分别在药物“开”和药物“关”状态下，按帕金森病评定量表（UPDRS），分别于手术前1d和开机后7d对帕金森病人的日常生活能力和运动能力进行评分，采用统计学软件（GraphPadPrismV5.0，GraphPadSoftwareInc.）进行统计学处理：对DBS前后进行配对t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。同时分别计算其改善率：改善率=（DBS前评分－DBS后评分）/DBS前评分×100%。2结果2.1临床治疗效果分析（表1）研究组病人围手术期未发生明显不良反应。所有病人在植入电极时均发生微毁损效应。DBS后，无论在药物“开”或“关”状态下，UPDRS日常生活能力和运动能力评分均明显改善（P＜0.05）。

2.2脑脊液中蛋白胶内和胶间分析（图1）明显差异蛋白点在正常对照组和未干预组有48个；在未干预组和微毁损组有14个，其中上调表达6个，下调表达8个；在未干预组和DBS组有18个，其中上调表达10个，下调表达8个；在微毁损组和DBS组有13个。未干预组和微毁损组与未干预组和DBS组的差异蛋白点仅3个相同（331、398、721），且除点331均呈下调表达外，另两个蛋白点在各组间的表达方向正好相反。在微毁损组和DBS组的13个明显差异蛋白点中，仅点331在未干预组和微毁损组及未干预组和DBS组的差异点中出现，其余

图1差异表达蛋白位点图1A未干预组和微毁损组比较，蛋白点824、398、1201、1211、1023、829呈上调表达，其他8个蛋白点呈下调表达1B未干预组和DBS组比较，蛋白点1044、533、671、392、721、415、1135、408、397、293呈上调表达，其他8

个蛋白点呈下调表达398331

721829824878104210231201121112751285144213811393113596710191044846721633671533535293331408415398392

1A1B表1帕金森病DBS手术前后UPDRS评分比较（x±s）评分“开”状态“关”状态日常生活能力评分术前（分）19.3±1.229.3±3.0术后（分）15.3±0.6①17.0±1.0①改善率（%）20.4±4.041.8±3.3运动能力评分术前（分）35.0±8.267.3±8.0术后（分）25.3±4.9①30.3±3.2①改善率（%）27.1±8.154.8±3.9注：①与术前比较，均P＜0.05中国微侵袭神经外科杂志2012年03月20日第17卷第3期ChinJMinimInvasiveNeurosurg,VOL.17,NO.3,March20,2012108··