马铃薯转基因工程的研究进展(东北农业大学研究生学院周晓 903175)[摘要]简要介绍马铃薯转基因技术方法。

着重对已获得的转抗真菌病基因、抗病毒基因、抗虫基因、改良品质基因的马铃薯的特征特性，以及将马铃薯作为植物生物反应器来生产有用蛋白质和疫苗等方面的研究成果进行了综述，同时还对转基因马铃薯进行了展望。

[关键词] 马铃薯; 转基因工程; 进展[前言] 我国马铃薯种植面积460万hm2，产量约7.5亿吨，是世界最大的马铃薯生产国。

目前尽管国内育种学家经过长期努力，以培育出许多优良品种，但还存在马铃薯的病虫害严重，种质资源贫乏，遗传背景也狭窄，育种材料(亲本)带毒，后代优良性状潜力发挥受阻，种薯退化严重等问题，这给马铃薯育种和中枢生产带来很大的困难。

马铃薯（solanum tuberosun L.）生产极易受到病虫害和非生物逆境因素的影响，尤以病毒性品种退化、真菌、病菌性病害最为严重。

据不完全统计，每年由此引起的马铃薯产量损失占总产量的30%以上[1]。

自1983年首次获得烟草转基因植株以来,以基因工程技术为核心的现代生物技术发展迅速,在近20多年的时间里,已有140多种植物相继被转化,内容涉及抗虫、抗真菌、抗病毒、品质改良等多个方面。

马铃薯由于其组织与细胞培养技术成熟、植株再生较容易,遗传转化的各种手段均可采用,又可以通过块茎无性繁殖将转基因的特性传递给后代而无需经纯化或多代选育,因此,马铃薯成为最早一批获得转基因成功的植物。

目前,利用基因工程技术改良马铃薯的品质、培育抗病虫新品种已经成为当今马铃薯育种的重要内容之一。

基因工程育种在改良单一不良性状(如品质、抗病性等)方面是其它育种方法无法比拟的。

目前，我国在马铃薯生产上还存如病虫害严重、品质不佳等诸多问题。

致使种植业者的收入微薄、积极性不高。

近年来，随着植物基因工程技术的发展，陆续培育出了一些优质抗病虫害的转基因新品种，特别是利用马铃薯作为生物反应器来生产有用的蛋白质和疫苗，从而增加些都为马铃薯的研究，开发和生产带来了曙光。

1 马铃薯转基因工程研究转基因技术是指用人工方法有目的地将来自一种生物的基因稳定地整合到另一种生物的基因组中，表达并遗传给子代的综合技术。

马铃薯是最早进行转基因研究的植物之一，是进入田间试验品种最多的转基因农作物之一，过科学家的努力已培育出了在多方面性能优良的马铃薯品种。

1.1抗菌病基因细菌和真菌病害是农业生产的主要病害,可导致农作物的严重减产甚至绝收,给农业生产造成巨大的损失。

为害马铃薯的细菌和真菌性病害主要有黑胫病、软腐病、晚疫病和青枯病等。

马铃薯晚疫病是由致病菌phytophtora (Mont) de Bary引起的一种真菌病害，是马铃薯生产中的头号敌人。

在我国因晚疫病而发生的产量损失每年平均亦达到10亿美元左右。

马铃薯真菌病种类繁多，其中最主要的是晚疫病。

1980年以来，在世界各地频频发生，给种植者带来了很大的经济损失。

几丁质和葡聚糖是多数真菌细胞壁的主要成分。

利用几丁质酶和烟草葡聚糖酶基因转化的植物具有降解真菌细胞壁的特性。

可以防止真菌类病害的发生。

现已将携带有Ⅰ型烟草β-1 ,3 葡聚糖酶基因和Ⅰ型菜豆几丁质酶基因的PBLGC质粒导入马铃薯品种“津引 8 号”中 ,获得的再生苗经分子检测呈阳性 ,有望具有抗真菌能力。

还有人将缺失 C 端信号肽序列的Osmotin 基因和在第 96 位氨基酸处发生琥珀突变的smotin基因置于CaMV双 35S启动子驱动下转化马铃薯 ,获得NPTII抗性植株。

经检测证明，smotin蛋白胞外分泌能够赋予转基因植株叶片抗晚疫病的能力。

将从黑曲霉中 PCR 扩增克隆的葡萄糖氧化酶(GO)基因与马铃薯病原诱导型启动子PrpI～I 融合构建植物表达载体PCAMGO,经农杆菌介导转化获得转基因马铃薯。

Southern blot 证明了外源基因在受体基因组中的整合。

用马铃薯晚疫病Phy2tophthora inf estans复合生理小种侵染的结果 ,转基因马铃薯中病原诱导型启动子可受晚疫病原的诱导;获得的转基因植株对晚疫病的抗性水平各不相同 ,多数表现发病时间推迟和病症明显减弱 ,表明病原诱导型启动子驱动 GO 基因表达在马铃薯抗真菌病基因工程中有很好的应用前景。

将人工合成的 4 种阳离子肽基因导入马铃薯并对马铃薯病原真菌和细菌的抗菌活性进行了测试 ,主要包括马铃薯晚疫菌、叶斑菌、细菌性软腐病菌等。

所获得的转基因植株对相应病原菌的抗性都得到增强。

1.2 抗病毒转基因1986年,美国科学家Beachy等首先将TMV外壳蛋白基因转入烟草和番茄,并使转基因植株获得了对TMV的抗性。

为害马铃薯的病毒病有30余种,其中普遍存在且危害严重的有PVX(马铃薯X病毒)、PVY(马铃薯Y病毒)和PLRV(卷叶病毒),而PVX+PVY、PVY+PLRV 混合型病毒病的危害更加严重。

马铃薯受病毒侵染后发生退化，造成不同程度的产量损失和质量损失，每年世界上由马铃薯病毒病造成的减产至少20%，敏感品种减产可达80%~90%,而后两种病毒复合侵染对马铃薯危害更大。

20世纪90年代我国马铃薯抗病毒基因工程就已取得了很大进展。

现已合成克隆出用于转化马铃薯的病毒外壳蛋白基因、复制酶基因、蛋白酶基因、基因调控区序列、核酶 cDNA 以及其他各种基因约 20 余种;建立完善了致瘤农杆菌介导的马铃薯转化技术;通过外壳蛋白介导、复制酶基因介导、表达基因调控区、表达该酶等多种途径,获得一批抗PVX,PVY,PVX 和PVY,PVY和PLRV ,PLRV ,PSTV 的转基因马铃薯栽培种。

“Favorita”、“虎头”、“克 4”已进入田间试验。

其中 ,转 PVY外壳蛋白基因的马铃薯在云南省已有大面积的种植。

抗病毒马铃薯的培育成功 ,对发展马铃薯生产具有重要意义。

1.3 抗虫转基因在世界范围内,虫害造成的损失约占农作物总收获量的13%,每年约损失数千亿美元[2]。

喷施农药等防治方法不仅成本高,而且严重污染环境,因此抗虫基因工程便成为人们研究的热门课题。

利用基因工程技术将外源基因导入植物细胞, 以期提高产量,改良性状,培育出适合人类需要的植物品种是现代植物遗传育种的重要途径。

自1987年世界上首次获得转Bt-toxin基因的烟草和番茄后,植物抗虫基因工程的研究得到了迅猛的发展。

而Bt基因是应用最多的基因, 全世界已获得50多种转Bt基因植物。

美国Mon- santo公司的Fischhoff小组还利用完全改造的cryⅢA基因获得了抗鞘翅目害虫的马铃薯[5]。

目前在美国转Bt-toxin基因的马铃薯已经实现商品化。

利用蛋白酶抑制剂的例子有:1997年Mckersie和Brown将植物来源的CPTI转化到马铃薯中,并对鳞翅目和鞘翅目害虫均具有良好的抗虫效果[6]。

国内中国科学院遗传所1992年克隆了CPTI的cDNA并转化烟草,抗虫测试结果,转基因烟草接种棉铃虫2~3龄幼虫,4d死亡率达50%,而对照却无死亡[7]。

利用植物凝集素的例子有:1997年Gatehouse 等试验结果表明,转GNA马铃薯显著降低了桃蚜的繁殖力[8]。

马铃薯抗虫基因的种类主要有：从苏云金杆菌中分离出的杀虫结晶蛋白基因-Bt基因、植物凝集素基因、昆虫蛋白酶抑制基因和豇豆胰蛋白酶抑制基因等。

植物凝集素具有一定的抗昆虫活性。

将雪花莲凝集素编码基因导入马铃薯，所获得的转基因植株对鳞翅目夜蛾科的昆虫表现出抗性。

研究发现转豆类几丁质酶基因的马铃薯也可对夜蛾科的昆虫产生抗性。

氢过氧化物裂解酶催化脂肪氢过氧化物裂解产生挥发性醛，涉及植物防御害虫和微生物侵染，还具有体外抗微生物的活性。

将HPL基因导入马铃薯，转基因植株表现出叶片中的脂肪酸氢过氧化物降解，以耗尽HPL的转基因植物饲喂蚜虫,蚜虫的产卵能力增加了两倍多。

因此认为催化HPL产生C6醛的导入可能对蚜虫具有防治作用。

来自植物自身的番茄抗线虫基因对马铃薯蚜虫也同样有效。

Mi基因是第一例具有不同抗性功能的基因其抗虫机理还不清楚。

1.4 改良品质国外在改良马铃薯块茎品质基因工程方面已取得许多进展。

通过导入细菌ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因提高了马铃薯干物质含量；转入巴西豆2S蛋白基因是块茎中蛋氨酸含量提高；通过转基因降低马铃薯种龙葵素含量，降低块茎贮存过程中的还原糖，降低多酚氧化酶活性等。

为了增加马铃薯块茎中必氨酸和含硫氨基酸的含量,现已成功地利用农杆菌介导法 ,将玉米 10ku 醇溶蛋白基因转入马铃薯中 ,并经检测得到了表达 ,使转基因马铃薯块茎中含硫氨基酸含量有明显提高 ,从而获得了品质更优良的转基因马铃薯。

为促进马铃薯块茎中干物质积累，提高淀粉含量Willmitzer等在促进光合作物产物从源到库的转移方面进行了许多研究。

我国北大蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室，克隆了菠菜磷酸丙糖转移转移蛋白基因，将其转入烟草和马铃薯，分别获得转基因植株，使叶片中的光合作物产物更快地向块茎转运，以提高马铃薯淀粉含量。

1.5 作为生物反应器以植物作为生物反应器可以大大降低生产成本 ,简化储存方式 ,现已成为各国科学家研究的热点。

这其中 ,多以马铃薯做试验材料。

现已将人铜锌超氧化物歧化酶hCu ,Zn～SOD基因 ,用农杆菌介导转化马铃薯 ,获得转基因马铃薯植株 ,经检测该基因在植株体内得到表达 ,表达的SOD 具有活性 ;有人通过农杆菌将含有禽流感病毒血凝素基因的表达载体导入马铃薯的幼茎外植体 ,对转化植株进行培养及温室栽培，地表达了禽流感病毒血凝素疫苗，结果显示 ,用马铃薯生产口服禽流感疫苗是可行的，过直接食用表达禽流感病毒血凝素的马铃薯 ,以期有效地防治禽流感。

从对马铃薯抗虫、抗病、抗真菌、改良品质、作为生物反应器方面的研究结果表明 ,利用转基因技术不仅可以改良马铃薯原有品种的品质和抗病虫害特性 ,而且还可以考虑进行多个基因的同时转化 ,这样可以使转基因材料更加完善。

同时还要看到 ,随着转基因研究中发现的问题及人们对转基因生物安全性的关注 ,转化植物必须考虑安全性问题和防止对环境造成污染。

相信随着研究的深入 ,转基因体系和相关理论将更加完善 ,生物安全性得到提高。

2 展望马铃薯作为世界上重要的农作物之一 ,具有较高的经济价值 ,在国际农产品贸易中占有举足轻重的地位。

随着基因工程的发展，研究者导入马铃薯植株的一般都是重组分子，尤其倾向于导入线性片段以取代以前的环型质粒载体，力求发掘新的高抗基因，实现导入的外源基因高效、多用途表达。

将一些有益的基因连在质粒载体上导入受体，去除了不必要的基因，可以更好的避免其他不希望的基因或核酸片段进入马铃薯植株中。

基因来源得到大大丰富，来源于其他植物、动物或微生物的有益基因均可被导入，得到抗虫、抗病毒、抗菌的马铃薯后代。