《细胞生物学》实验指导目录实验一细胞大小测定和生物绘图法（验证性）2实验二细胞中过氧化物酶的显示（验证性）2实验三细胞内糖类的显示（验证性）2实验四细胞Feulgen反应（验证性）2实验五动物细胞培养（综合性）4实验六细胞膜通透性的观察和细胞活力测定（创新性）4实验一细胞大小测定和生物绘图法一、实验目的1. 掌握用测微尺测定细胞大小的原理和方法。

2. 掌握生物绘图的基本方法。

二、实验原理（一）测微尺的原理测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两尺配合使用，可以测量细胞大小。

目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃圆片，圆片中央刻有一条直线，此线分为若干格。

物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长1mm，被等分为100格，长为0.01mm（10um）。

当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。

因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像，而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需要先用物微尺来测定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度，然后再用以测定细胞大小。

将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：物测微尺格数目微尺每格所代表的实际长度= ×10um目测微尺格数例如：目微尺是100倍，其对应的物微尺使80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/100=8um。

测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5倍，则此细胞横径为8×5=40um。

（二）生物绘图的基本要求1. 具有高度的科学性，不得有科学性错误。

形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。

2. 图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。

3. 绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。

4. 绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。

5. 绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。

注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。

6. 绘图完成后在绘图纸上方要写明实验名称、班级、姓名、时间，在图的下方注明图名及放大倍数。

三、实验材料和实验用品1. 实验材料：口腔黏膜上皮细胞，洋葱内表皮，西红柿，芹菜，韭菜，红辣椒2. 实验用品：普通光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、消毒牙签、烧杯、吸管、0.9%生理盐水、0.1%亚甲基兰、蒸馏水、吸水纸，HB及2H或3H绘图铅笔、橡皮、直尺、绘图纸、铅笔刀、各种细胞标本玻片。

四、方法步骤（一）细胞形态结构的观察1. 涂片法：人口腔上皮细胞的观察：1）在洁净的载玻片中央，滴一滴生理盐水。

2）用消毒牙签的一端，在漱净的口腔侧壁上轻轻的刮几下。

3）把牙签上附有碎屑的一端，放在载玻片上的生理盐水滴中涂匀。

4）用镊子夹起洁净的盖玻片，将它的一边先接触载玻片上的生理盐水滴，然后，轻轻地盖在水滴上。

然后在盖片的一侧加一滴0.1%亚甲基兰染液，在盖片的另一侧用吸水纸吸取，染色后细胞核被染成深蓝色，细胞质浅蓝色。

5）用显微镜观察细胞形状，细胞呈扁平鳞状。

2. 西红柿果肉细胞涂片制作似人口腔上皮细胞，但将生理盐水换成蒸馏水，且不必染色就可直接观察。

细胞大小形状如何？3. 撕片法：撕一小片植物表皮（洋葱、芹菜和韭菜），放在盛有一小滴蒸馏水的载玻片上，用镊子展平，盖上盖玻片在显微镜下观察。

细胞大小和形状如何？4. 取红辣椒一片，用刀片刮去果肉，将表皮制成临时装片，用显微镜观察表皮细胞，能看见胞间连丝吗?（二）细胞大小的测定1. 将目微尺放于目镜内2. 将物微尺放在显微镜的载物台上3. 小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处。

4. 记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目镜尺每格所代表的实际长度目镜尺每格所代表的实际长度=物微尺格数/目微尺格数×10um5. 将制作的各种细胞临时装片置于载物台上，测定细胞的大小（包括长径和短径）。

（三）生物绘图生物绘图的方法有多种，最长见的是点点衬阴法。

点点衬阴法即将图形画出后，用铅笔点出圆点，以表示明暗和深浅，给予立体感。

在暗处点要密，明处要疏，但要求点要均匀，点点要从明处点起，一行行交互着点，物体上的斑纹描出再点点衬阴，点点衬阴法要求不能用涂抹阴影的方法以代替点点，此点初学者要尤为注意。

线条的要求：线条要均匀、不可时粗时细；线条边缘要圆润、光滑，不可有深浅和虚实的区别。

点的要求：“点点衬阴”法可显示图像的立体感，更富有形象相生动性。

粗密点用来表示背光、凹陷或色彩浓重的部位；细疏点用来表示受光面或色彩淡的部位。

点点要圆，用笔尖垂直向下打点，根据明暗需要掌握点的疏密变化，切忌采用艺术画的写生画法，不可用涂抹表示树阴。

轮廓图（左）和细胞图（右）步骤：1.观察：绘图前要对被画的对象(植物细胞、组织、器官以及外形等)做细心观察，选择有代表性的、典型的部位起稿。

2.起稿：起稿是勾画轮廓的过程：注意位置、大小。

将绘图纸放在显微镜的右方，左眼观察显微镜图像，右眼看绘图纸绘图。

绘图起草时先用较软的铅笔(HB)，将所观察对象的整体和主要部分轻轻描绘在绘图纸上，下笔要轻．尽量少改不擦。

3.定稿：对照所观察的实物，全面检查起稿的草图，进行修正和补充，再用硬铅笔(2H或3H）将草图画出来，之后可将草图擦去。

4.按注图要求绘图，写上图名及班级、姓名等。

五、注意事项1. 制作临时装片时避免产生气泡。

2. 用物微尺标定的目微尺每格长度的数值代表在某一放大系统下的情况，这一数值会随物镜的放大率而改变。

因此，在什么放大倍数的物镜下标定的目微尺只能在同一放大倍数的物镜下测定细胞的大小。

3. 绘图前认真的观察标本，搞清实物标本的结构特点，切忌抄书或凭空想象。

六、作业绘出你所观察到的人口腔上皮细胞、洋葱表皮细胞核芹菜和西红柿果肉细胞（或红红辣椒、韭菜、韭菜表皮细胞）图，指出各部分的名称。

实验二细胞中过氧化物酶的显示一、实验目的1.观察过氧化物酶的分布2.掌握过氧化物酶显示方法的原理及操作步骤二、实验原理过氧化物酶在细胞中定位于过氧化物酶体内，其反应原理为：过氧化物酶将H2O2分解，产生的氧能把联苯胺氧化为联苯胺蓝，进而转变为棕色的联苯胺棕。

三、实验用品1. 材料：洋葱根尖2. 药品：0.1%钼酸胺，1%联苯胺，生理盐水（0.7%-0.9%）0.1%钼酸胺：取0.1g钼酸胺溶于100ml双蒸水中。

1%联苯胺：取1g联苯胺溶于100ml双蒸水中。

联苯胺混合液：联苯胺（研磨）0.2g溶于100ml蒸馏水，过滤，于滤液中滴加3% H2O22滴，储存于棕色瓶中。

3.仪器用品：显微镜、载玻片、盖玻片、解剖刀片。

四、实验步骤1. 取新鲜洋葱根尖于载玻片上压片。

2. 加1滴0.1%钼酸胺，置5分钟。

3. 加1%联苯胺溶液1滴，待其出现蓝色。

4. 用生理盐水冲洗1次。

5. 加盖玻片，观察。

五、观察结果过氧化物酶阳性细胞的细胞质中有棕黄色物质，因含酶的多少不同，颜色深浅不一，深者为过氧化物酶阳性细胞，浅者为过氧化物酶弱阳性细胞，而无色者为过氧化物酶阴性细胞。

实验三细胞内糖类的显示过碘酸雪夫氏反应(peIiodic acid schiff’s reaction，PAS反应)由McManus于1946年在Feulgen反应的基础上发展而来，是显示糖原的最经典、也是最直接的细胞化学方法。

该反应首先由强氧化剂过碘酸将多糖中葡萄糖的乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成两个游离醛基(-CHO)，然后，游离醛基再与Schiff's 试剂反应生成紫红色的化合物，颜色深浅与多糖含量成正比。

由于单糖在固定、脱水和包埋等组织化学操作过程中被抽提掉，故一般组织标本上所能显示的糖类主要是多糖，包括糖原、黏多糖、黏蛋白、糖蛋白、糖脂、淀粉和纤维素等，它们都是由D-葡萄糖的分支或直链组成，因此要确定此红色物质是否是糖原还需要同时进行对照实验。

糖原可被唾液淀粉酶水解，先用唾液淀粉酶作用再进行PAS显色，若反应为阴性，则表明是糖原，反之则为其他多糖。

【实验目的】掌握多糖鉴定的PAS法的原理与技术，并观察细胞内多糖的分布。

【实验器材、材料和药品】1．器材显微镜、剪刀、镊子、解剖针、染色缸、载玻片、盖玻片、吸水纸、恒温水浴箱、小烧杯（10ml）2．材料马铃薯块茎3．试剂及其配制Schiff试剂、0.5%过碘酸溶液、70%乙醇、pH4.2磷酸缓冲液、淀粉酶【实验方法和步骤】切取马铃薯块茎，放入过碘酸溶液中，10min后用70%乙醇漂洗一下。

将薄片放入Schiff试剂中20～25min。

取出薄片放入70%的乙醇中浸1min。

用70%乙醇中冲洗（将薄片放在载玻片上，用吸管吸乙醇滴片）。

加上盖玻片镜检。

对照薄片可于切下后，以pH4.2磷酸盐缓冲液配制的淀粉酶消化40min，再进入染液。

结果：块茎组织细胞内可见到紫红色或深红色淀粉颗粒，对照无色或色淡。

【作业与思考题】简述PAS法的反应原理，绘图描述细胞内多糖的分布。

实验四细胞Feulgen反应【实验目的】了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。

【实验原理】DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成。

DNA经1N盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的双键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。

Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。

因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。

紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。

材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。

图4-1 Feulgen反应【实验仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。

（二）材料洋葱鳞茎或根尖（三）试剂1．1N 盐酸的配制取82.5ml比重1.19的浓盐酸加蒸馏水至1000ml。

2．Schiff试剂的配制及保存称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。

然后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1N HCl，冷却至25℃时，加入0.5g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。