细胞生物学实验汇总————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：实验一、二：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察【基本原理】细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。
凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。
凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。
细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。
可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。
本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。
当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。
由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。
【方法步骤】1．制备土豆凝集素液和红细胞悬浮液，制备无血清的鸡红细胞悬液，使凝集素液和红细胞悬液混合，静置后，在光镜（低倍）下观察凝集素使红细胞凝集的现象。
（以PBS 缓冲液加2％血细胞作对照实验）[土豆凝集素的制备：称取土豆去皮块茎2g , 加10 mL PBS 缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素） , 载玻片上滴一滴土豆凝集素,再滴一滴2％红细胞液,充分混匀静置20 min , 低倍显微镜下观察血球凝集现象。
] 2．观察10%的鸡红细胞悬液，可见该悬液为一种不透明的红色液体3．观察溶血现象取一支试管，再加入4ml 蒸馏水，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，混匀后注意观察溶液颜色的变化，可见溶液由不透明的红色变成透明的红色液体（可将试管贴靠在书上，隔着试管看书中的字，如发现溶血则文字可被看清）。
4．观察鸡红细胞对不同物质的通透性（1）取一支试管，和0.17M 的Nacl 溶液4ml，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，轻轻摇匀，用上述方法观察是否出现溶血现象，如出现溶血，记下发生溶血所需要的时间（从加入4ml 溶液算起）（2）按上述方法分别加入下列9种溶液是否导致红细胞溶血并记录实验结果。
①0.17M 氯化铵②0.17M 硝酸钠③0.17M 硫酸钠④0.17M 醋酸胺⑤0.17M 草酸铵⑥0.17M 葡萄糖⑦0.17M 甘油⑧0.17M 乙醇⑨0.17M 丙酮【实验结果】1、土豆凝集素能使鸡红细胞凝集，PBS 对照液中红细胞分散均匀。
对照组未凝血，实验组凝血。
2、氯化钠、硝酸钠、硫酸钠溶液不溶。
醋酸铵>草酸铵>氯化铵>乙醇>甘油>丙酮>葡萄糖。
膜通透性大小主要取决于分子大小和分子极性。
小分子比大分子容易通过，非极性比极性易通过，带电荷离子高度不透。
实验三：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合【基本原理】两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。
在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。
人工细胞融合开始于五十年代，六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广。
细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。
不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。
因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。
这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。
细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，如研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、育种等。
细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus) ，聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）和电脉冲。
目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。
聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH2OCH2)n CH2OH，相对分子质量在200-6000 均可用作细胞融合剂。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
【方法步骤】1．采血及鸡红细胞悬液的制备（同教材57 页）。
2．（共2 组）取鸡红细胞悬液1mL，移人10mL 离心管，加入4mL 0.85％生理盐水混匀。
1000r／min 离心5 min。
3．弃上清液(用吸管吸去)，加0.85％生理盐水5mL，用指弹法（或吸管轻吹）将细胞团块弹散，混匀后1000r／min 离心5min；重复上述条件，再离心洗涤1 次。
4．收集最后1 次离心沉淀的血细胞，加入适量（5－8mL）的GKN 液，轻吹散，混匀。
5．（每4 人）取悬液1mL 到1 个试管中，加入0.5 mL 预热的50％PEG 混匀，置于30℃水浴中温浴3－5min；取未融合和融合的血细胞悬液各1 滴分别滴于载玻片上的两侧，盖上盖玻片。
6．利用光学显微镜(高倍) 以未融合细胞为对照观察2 个靠近细胞形成融合的过程。
【结果观察】在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个同核体细胞。
要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。
【实验结果】在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个同核体细胞。
要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。
实验四：线粒体和液泡系的超活染色与观察【基本原理】线粒体是细胞内一种重要细胞器，细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。
活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。
詹纳斯绿B（Janus green B）是线垃体的专一性活细胞染色剂，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，从而使线粒体显色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。
中性红对液泡系的染色具有专一性，将活细胞中的液泡系染成红色。
【方法步骤】1．线粒体的超活染色与观察1）口腔上皮细胞线粒体的超活染色：1/5000 詹纳斯绿B1-2 滴，口腔上皮细胞（牙签刮取），载玻片于37℃恒温染色10-15min，显微镜下观察。
2）洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察：1/5000 詹纳斯绿B 溶液1-2 滴，洋葱鳞茎内表皮，载玻片于37℃恒温水浴染色10-15min，显微镜下观察。
2．小麦（或绿豆）幼根根尖液泡系的中性红染色观察小麦（或绿豆）幼苗根尖（1-2cm）纵切面切片，1/3000 中性红溶液1 滴染色5-10min，载玻片于37℃恒温水浴，盖上盖玻片压扁根尖，显微镜下观察。
【实验结果】口腔上皮细胞的线粒体分布洋葱内表皮细胞线粒体分布植物根尖液泡的中性红染色实验五：植物细胞微丝束的光学显微镜观察【基本原理】细胞骨架在通常情况下不稳定：如低温、高压、饿酸处理等。
当用适当浓度的TritonX-100 处理细胞时，能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰，M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，经考马斯亮蓝R250 染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。
微丝、微管和中间纤维都是直径很小的结构，最大的单根微管才25nm 左右，只能在电镜下才能观察到。
目前研究细胞骨架的主要方法是应用高压电镜或免疫荧光显微镜技术。
本实验用普通光镜观察到细胞骨架，是因为骨架纤维成束分布、结构经染色后，有夸大作用。
由于细胞经TritonX-100 抽提后剩下的主要是细胞骨架成分，使得显现更清晰。
细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。
它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。
光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% Triton X-100 处理细胞，可使细胞膜溶解，而细胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰R250 染色，使得胞质中细胞骨架得以清晰显现。
【实验用品】1．材料：新鲜洋葱鳞茎2．试剂1）M 缓冲液（pH 7.2）各成分终浓度为：50mmol/L 咪唑(MW:68.08)；50mmol/L KCl(MW:74.55)；0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30)；1mmol/L EGTA(MW:380.36)；0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)；1mmol/L DTT(MW:154.3)2）6mmol/L PBS 磷酸缓冲液（pH 6.5）：KH2PO4 : Na2HPO4.2H2O = 7:33）0.7% NaCl 生理盐水4）1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于M-缓冲液5）3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL，PBS 88mL6）0.2% 考马斯亮蓝R250 染液200mL：考马斯亮蓝R250 0.2g；甲醇46.5mL；冰乙酸7mL；蒸馏水46.5mL3．仪器：光学显微镜，镊子，剪刀，试管，表面皿，滴管，载玻片，盖玻片【方法步骤】【实验结果】洋葱鳞茎外层与内层的表皮细胞比较（放大倍数10×20）附：各种主要试剂的作用1．Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非离子去垢剂；适当浓度的Triton X-100，可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存。
2．M－缓冲液和磷酸缓冲液作用：维持细胞的渗透压。
3．EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2＋，主要是高浓度的Ca2＋可是微管解聚，因此加入EGTA 来降低Ca2＋的浓度。