冻存细胞的复苏
1、于液氮罐中取出冻存管。

2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。

3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。

4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。

5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。

组织块法培养骨骼肌细胞
1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。

2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。

3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。

5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。

翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。

入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。

贴壁细胞的传代和冻存
1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。

2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。

3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待
见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。

4、加培养液终止消化。

5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。

6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。

7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。

8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。

9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃
2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。

细胞计数
血球计数板每一大方格长为1mm，宽为1mm，高为0.1mm，体积为0.1mm3，可容纳的溶液是0.1μl，那么每ml溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中数出的细胞数的10000倍。

实验步骤
（一）准备计数板：用酒精清洁计数板和盖玻片，然后用吸水纸轻轻擦干（二）制备细胞悬液：用胰蛋白酶消化单层培养细胞或收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。

要求细胞密度不低于104/ml，若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm，3min），重悬浮于少量培养液中。

（三）加样：将盖玻片盖在计数板两槽中间。

用吸管轻轻吹打细胞悬液，吸取少量细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧加细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。

否则要将计数板和盖玻片擦干净重新加样。

（四）计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。

（五）计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。

细胞数/毫升原液=（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数
转染
Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）：
1、转染前一天，胰酶消化细胞并计数，在24孔板内放入玻片，细胞铺板，使其在转染日细胞密度为70-85％。

细胞铺板在1ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2、配制溶液A和溶液B
（1）溶液A：对于每孔细胞，使用50ul无血清培养基稀释0.8ugDNA，轻轻混匀。

（2）溶液B:使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用50ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。

3、室温下孵育5min。

4、将溶液A逐滴加入溶液B中，轻轻混匀。

室温放置20分钟。

5、将24孔板中的旧培养液吸出，用无血清培养基清洗两次。

6、直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

在4-6小时后观察细胞，更换培养基。

（step1--step6: 转染1）
7、在37℃，5％CO
2
中继续培养。

8、48h后，用荧光显微镜观察。

细胞凋亡检测
1、取洁净盖玻片于多聚赖氨酸中浸泡5min，紫外消毒，无菌超净台内吹干。

将盖玻片置于培养皿中，接种细胞培养，使为50%-80%满。

2、加入H
2O
2
（200μmol/l）刺激细胞发生凋亡，2h后换液，继续培养过夜。

（step1—step2:凋亡1）(H
2O
2
储存浓度为：0.01μmol/μl)
3、取出细胞爬片（注意细胞面朝上），放入玻璃培养皿中，吸尽培养液，用丙酮溶液室温下固定细胞10 min。

4、去固定液，用PBS洗涤2遍，每次3min ，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床或手动晃动数次。

5、加入0.5ml Hoechst 33342 染色液，染色5min，也用摇床轻轻晃动，注意避光。

6、用PBS洗两遍，每次3分钟。

7、滴10ul封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免空气，使细胞接触封片液（细胞面朝下），切勿弄反。

8、设空白对照：与试验平行不加H
2O
2
，只加培养液的空白对照。

细胞增殖的检测（MTT法）
1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板（96孔平底板）使待测细胞调密度至5000-8000孔，5%CO
2
，37℃培养过夜。

2、第二天加入浓度梯度的H
2O
2
（0、50、100、200、400、800μmol/l）。

药
物浓度6个梯度,设3个复孔。

3、5%CO
2
，37℃孵育2小时，倒置显微镜下观察，换液，每孔100ul培养液,继续培养过夜。

（step1—step2: MTT 1）
4、每孔加入20ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

5、终止培养，小心去除孔内培养液。

6、每孔再加入150ul二甲亚砜，在酶联免疫检测仪中振荡混匀，使结晶物充分溶解，OD490nm处测量各孔的吸光值。

免疫荧光
1、细胞培养在盖玻片上，长到60-80%时取出（注意细胞面朝上）放到玻璃培养皿中。

2、PBS洗细胞3次，每次3min。

•3、丙酮溶液室温下固定细胞10 min，PBS洗两次，用滤纸吸干多余液体。

•4、10%羊血清温育10min。

•5、弃封闭液，直接滴加约15µL（1：50稀释）抗微管蛋白抗体(一抗)在生长有细胞的盖玻片上，放入湿盒内，4℃孵育过夜。

（step1—step6: MTT1）•6、PBS洗涤3次，每次洗3min。

用滤纸吸去水分，略干燥。

•7、在盖玻片上滴加20 µL左右FITC-羊抗鼠抗体（二抗），放在湿盒内，37℃温育45min，注意避光。

•8、用PBS洗细胞3次，每次5min。

•9、DAPI染色3min。

11、用PBS洗细胞3次，每次5min。

•12、略干燥后，用甘油-PBS(9:1)封片，置荧光显微镜下观察。