• 第二类是酶切。步骤繁琐，费时，检测已 第二类是酶切。步骤繁琐，费时， 知SNP。结果不稳定。 。结果不稳定。 • 第三类方法中包括测序、Pyrosequencing 第三类方法中包括测序、 等技术。此外还有芯片等技术可用于SNP 等技术。此外还有芯片等技术可用于 分析； 分析；Pyrosequencing技术它既可进行 技术它既可进行 DNA序列分析，又可进行基于序列分析的 序列分析， 序列分析 SNP检测及表观遗传学甲基化的分析以及 检测及表观遗传学甲基化的分析以及 大规模的等位基因频率测定 。
• 条件要求
• 1、高分辨率：扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA链的 解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果 仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。那么什么样的分 辨率才是高分辨率呢？根据仪器现有的功能测试，在熔解 操作时每摄氏度至少要获得10个数据点，这是对仪器的最 低要求。此外，温度均一性也同样重要。如果两孔之间温 度相差0.1°C，就很可能导致最终的熔解温度相差0.1°C， 这样就无法保证HRM分析结果的准确性。 • 2、饱和染料：为什么要饱和染料呢？因为饱和染料饱和 了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发 生重排，荧光信号能准确的反映DNA的解链。这样熔解曲 线才有了更高的分辨率。
• 方法
• 在PCR反应前将LC Green饱和荧光染料与 PCR反应体系 混合，然后将PCR产物直接放入LightScanner、HR-1或 Rotor-Gene 6000仪器中，在一定的温度范围内将PCR扩 增产物进行变性，就是对PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐解链。 在HRM分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双 链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了。HRM仪器通过 照相机，记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图， 就生成了熔解曲线 。
• 有些研究并不需要完全的基因型。而只需知道 有些研究并不需要完全的基因型。 DNA序列是否匹配，例如：组织移植、基因 序列是否匹配， 序列是否匹配 例如：组织移植、 表型的相关性和辩证性．在活器官移植中。 型．表型的相关性和辩证性．在活器官移植中。 需要对HLA进行基因分型．这个主要牵涉到 进行基因分型． 需要对 进行基因分型 这个主要牵涉到HLAA，B，C和DR等几个位点 A，B，C和DR等几个位点．当两个个体的熔解 等几个位点． 曲线完全相同时就说明HLA基因型完全匹配． 基因型完全匹配． 曲线完全相同时就说明 基因型完全匹配
Clinical Chemistry 54:10 1648–1656 (2008）
•
Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮 测序反应中，只加入一种dNTP（脱氧核糖核苷酸） ，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可 以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。 PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反 应中掺入的核苷酸数目成正比
• 突变扫描
• 目前应用 目前应用HRM进行突变扫描的基因有：C进行突变扫描的基因有： 进行突变扫描的基因有 kit、乙酰辅酶 脱酶的中链、原肉毒碱缺乏 脱酶的中链、 、乙酰辅酶A脱酶的中链 症、RET、表皮生长因子受体 、表皮生长因子受体EGFR、K— 、 ras、苯丙氨酸羟化酶、p53、HER2、囊肿 、苯丙氨酸羟化酶、 、 、 性纤维化基因的几个外显子等等． 性纤维化基因的几个外显子等等．
HRM在分子诊断中的应用
• • • • 基因分型 突变扫描 甲基化分析 序列配对
• 基因分型 • 传统的基因分型方法或者耗时费力，或者需要购 买价格不菲的探针。HRM分析无需制备探针；有 了饱和染料，PCR产物全程被标记，因此所有的 熔解区域都能检测到。对于同一扩增子内的不同 杂合体，通过曲线形状的差异也能区分开。
• HRM新技术的介绍 • 1、未标记探针HRM • 在HMR的基础上发明一种不带荧光标记的探针，由原来 的单一扩增产物的熔解曲线模式转变为由扩增产物与探针 两部分组成的模式。 • 2、弹回探针 • 弹回探针(snapback primer)是在引物末端加一个与靶片段 (snapback primer) 的突变区域互补的尾巴序列，反应体系是不对称 PCR(asymmetric PCR)，带有弹回探针的引物为过剩引 物(excess primer，EP)，另一条引物为限制引物(1imiting primer，LP)。扩增反应前几个循环为双链扩增，15个循 环左右后为单链扩增。熔解曲线区域包括PCR产物区与探 针区，通过对探针区的熔解曲线进行基因分型、突变等分 析
• 甲基化分析 • HRM分析还为DNA甲基化状态的检测另辟 蹊径。DNA样品通过亚硫酸氢盐的处理， 将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。这样， 原先未甲基化模板所产生的PCR产物比甲 基化模板的Tm要低。
Nucleic Acids Research,2009,Vol.37,No.12
Hale Waihona Puke • 序列配对• 目前突变 目前突变/SNP的研究手段大致有三大类， 的研究手段大致有三大类， 的研究手段大致有三大类 • 一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，比如Taqman探 一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，比如 探 针法。显著特点是速度快，通量大。缺点是只能检测已知SNP， 针法。显著特点是速度快，通量大。缺点是只能检测已知 ， 昂贵。 昂贵。
HRM
_____一种用于突变扫描和基因分型的遗传学分析方法
• 高分辨率熔解曲线(high resolution melting)是在 实时荧光PCR基础上发展起来的一种新的实时定 量新技术。 • 常规Real-time PCR利用SYBR Green染料标记 DNA双链，但是SYBR Green是一种大分子即不 饱和染料，不能保证PCR产物全部的小沟都嵌合 上SYBRGreen，并且嵌合到产物中的染料如果在 扩增过程中不能及时脱落，还会抑制PCR反应。 • HRM采用新型的饱和染料如LC Green， SYTO 9 等。不仅没有不饱和染料的缺点，而且更易于检 测单碱基突变、小片段插入或缺失。
HRM主要特点
• 高分辨率溶解曲线（高分辨溶解曲线突变检测）是理想的 SNP检测手段： 快速、高通量—LightScanner 5分钟完成96/384孔板的 PCR产物检测， 20000个SNP/天 准确、灵敏度高、特异性好—LightScanner100%准确性 、特异性（<400bp）；准确性96.4%和特异性99.1%（ 400~1kb） 重复性好—LightScanner重复性100% 费用低—LightScanner检测SNP每个样品的成本为1RMB 操作简便—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板） 放入仪器内便可，软件自动基因分型
• 原理
• HRM是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与 PCR产物的结合情况。SNP位点碱基不同会使双链 位点碱基不同 DNA的TM值发生变化从而双链DNA在升温过程中先 值发生变化 后解开，形成不同的融解曲线形状，荧光染料从 局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就 可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯 合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有 效区分不同SNP位点与不同基因型。
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THANKS !
• HRM已经在人类(双倍体)和微生物(单倍体)的基因分型中 得到应用．人类疾病基因包括球蛋白、囊肿性纤维化、V 因子、凝血素、血色沉着病蛋白、血小板抗原、乳糖分解 酵素和MGMT启动子区域的甲基化．微生物基冈有： hsp65、16s rRNA基因、gyrA等．
• SNP相关研究方法比较： 相关研究方法比较： 相关研究方法比较