内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
Small Amplicon Genotyping
扩增小片段直接进行基因型鉴定
•使用已知Tm值的双链DNA做温 度内标，低温内标Tm(~61℃) , 高温内标Tm (~92 ℃) •内标能够实现96/384孔板的温度 均一矫正。 •PCR片段的Tm值范围： 70-88 ℃ •优点：不需要探针，直接利用 PCR产物针对已知突变位点进行 基因分型
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
PCR
Lightscanner高分辨溶解曲线结果
LC Green plus —— 高分辨溶解曲线专用荧光染料
Saturating dye
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
HRM – Lunaprobe genotyping
HRM – Lunaprobe genotyping
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
Class 1 C:T, G:A Class 3 C:G
SNP及突变研究的最新工具 高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting） 突变筛查和基因分型系统
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting） • 高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析;T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
Mutation Scanning
未知SNP扫描
M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。
Bernhard等对Barley的eukaryotic translation
initiation factor 4E (eIF4E) gene基因外显子进行突变扫描结果
Bernhard J. HoWnger · Hai-Chun Jing ·Kim E. Hammond-Kosack · Kostya Kanyuka (Barley Application) Theor Appl Genet (2009) 119:851–865 DOI 10.1007/s00122-009-1094-2 数据来自英国洛桑农业实验站
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
Class 2 C:A, G:T
Class 4 A:T
1 Probe, 2 SNPs, 1 Amplicon
2 Probes, 2 SNPs, 1 Amplicon- ApoE
2 Probes, 2 SNPs, 2 Amplicons - HFE
Amplicon Scanning – 发现新的突变
High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的 Tm值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：
LightScanner突变检测原理 Wild type Tube 1 Homozygote Tube 2 Tube 3 Heterozygo te
rr
Mix Rr:rr by 1:1 Rrrr
RR
Mix RR:Rr by 1:1 RRRr Rr
David De ，Yong Song at el.Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding (2010) 25:67–90