Class 2 C:A, G:T
Class 4 A:T
1 Probe, 2 SNPs, 1 Amplicon
2 Probes, 2 SNPs, 1 Amplicon- ApoE Amplicon-
2 Probes, 2 SNPs, 2 Amplicons - HFE
Amplicon Scanning – 发现新的突变
在PCR反应前加入 LCGreen 荧光染料 • 时间大约2小时（包含试剂准备） 时间大约2小时（包含试剂准备）
在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析 • 大约需要5 大约需要5-10 分钟
数据分析和处理 • 大约需要5 大约需要5-10 分钟
PCR产物可以直接进行下游的测序分析等（如 需要） • 大约需要30-60分钟 大约需要30-60分钟 30
LightScanner适于 适于SNP分析 适于 分析
1. 速度、通量—LightScanner 5～10分钟完成96/384孔板的PCR产物检测 ， 20000个SNP/天 2. 3. 4. 5. 6. 可检测未知、已知突变，对已知突变进行Genotyping 检测未知及已知突变准确性100%、特异性92.7% （<400bp） 重复性—LightScanner重复性100% 费用—LightScanner检测SNP每个样品的荧光染料成本为1.6RMB 操作—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板）放入仪器内便可， 软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
谢谢！
Bernhard J. HoWnger · Hai-Chun Jing ·Kim E. Hammond-Kosack · Kostya Kanyuka (Barley Application) Theor Appl Genet (2009) 119:851–865 DOI 10.1007/s00122-009-1094-2 数据来自英国洛桑农业实验站
SNP及突变研究的最新工具 及突变研究的最新工具 高分辨率熔解曲线（ 高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting） ） 突变筛查和基因分型系统
北京思博全科技有限公司
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting） • 高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
HRM – Lunaprobe genotyping
HRM – Lunaprobe genotyping
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
Class 1 C:T, G:A Class 3 C:G
Mutation Scanning
未知SNP扫描 未知SNP扫描 SNP
M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。
Bernhard等对Barley的eukaryotic translation
initiation factor 4E (eIF4E) gene基因外显子进行突变扫描结果
Rosario Muleo（2009）等用HRM方法对三个品种的SSR DCA4进行分析，DCA4的等位基因有131bp的重复序列，杂 合等位基因的序列为131-133bp，分析结果如图8所示，HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个 等位基因只相差2bp。 三种颜色（浅灰，深灰、黑色）表明3种不同的品种。
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
Rosario Muleo等得出结论： HRM是一种快速、重复性 高、成本低，操作简单，且 可以应用于其他物种的SNP 检测及SSR基因分型的方法。
Rosario Muleo,Marir Chiara Colao,Dario Miano at el. 2009 Genome52:252-260
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• 高分辨熔解曲线（High熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
• HRM仪器
2005 LightScanner 96/384
•96/384 孔板 •~8 分钟 板 分钟/板 •~2-6 秒/样品 样品 •温度均一性：± 0.15oC 温度均一性： 温度均一性 •数据采集速度：大于100pts/秒 数据采集速度：大于 数据采集速度 秒 •升温速度： 0.1oC/秒 升温速度： 升温速度 秒
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
Small Amplicon Genotyping 扩增小片段直接进行基因型鉴定
•使用已知Tm值的双链DNA做温 度内标，低温内标Tm(~61℃) ,高 温内标Tm (~92 ℃) •内标能够实现96/384孔板的温度 均一矫正。 •PCR片段的Tm值范围： 70-88 ℃ •优点：不需要探针，直接利用 PCR产物针对已知突变位点进行 基因分型
LightScanner突变检测原理 突变检测原理 Wild type Tube 1 Homozygote Tube 2 Heterozygote
Tube 3
PCR
Lightscanner高分辨溶解曲线结果 高分辨溶解曲线结果
LC Green plus —— 高分辨溶解曲线专用荧光染料
Saturating dye
High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列变化的 是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的 （ 是基于有序列变化的 之间微弱的 Tm值差异，通过 值差异， 片段熔解曲线的差异进行突变检测， 值差异 通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如： 片段熔解曲线的差异进行突变检测 比如：
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
•HRM 检测 • 60 分钟内完成定量 PCR 和 HRM 检测 • HRM检测升温速度可以在 0.05 ～ 0.90oC/秒之间调 检测升温速度可以在 秒之间调 节 •在升温速度小于 在升温速度小于≤0.3℃/秒时，温度均一性：±0.05oC 秒时， 在升温速度小于 ℃ 秒时 温度均一性： • 数据采集速度：20pts/秒～400pts/秒（与升温速度有 数据采集速度： 秒 秒 关） • 0.3oC/秒 升温速度 67 pts/ ℃ 秒 升温速度= • 0.05oC/秒 升温速度 = 400 pts/ ℃ 秒
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• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
rr
Mix Rr:rr by 1:1 Rrrr
RR Mix RR:Rr by 1:1 RRRr Rr
David De ，Yong Song at el.Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding (2010) 25:67–90
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• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化