一、 组织总RNA的提取 相关试剂：Trizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1. 取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2. 转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3. 按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4. 4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5. 小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6. 室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7. 弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8. 弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9. 弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10. 沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。

 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）

相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）

（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。 二、 逆转录（RNA逆转录成cDNA） 相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），100μl冰盒，制冰机，PCR管）

根据逆转录试剂盒（TOYOBO公司）说明书进行，反应体系及条件如下： 试剂 使用量（μl） Rnase Free H2O 11.75-Y Oligo（dT） 1 Total RNA（<1000ng） Y Total Volume 12.75 65℃，5min后，立即置于冰上。 试剂 使用量（μl） 上一步变性后RNA溶液 12.75 5×RT Buffer 4 dNTP Mixture（各10mM） 2 Rnase Inhibitor（10U/μl） 0.25 Rever Tra Ace 1 Total Volume 20 然后放置于PCR仪上，反应程序为： 42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。所得cDNA放置于-20℃保存。

三、 PCR反应 相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），100μl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）

反应条件：95℃,预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。 反应结束后，取5μl PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

试剂 使用量（μl） ddH2O 6.0 反转录产物 1.0 10×PCR Buffer 1.0 dNTP（10mmol/l） 0.2 Taq酶（1U/μl） 0.4 Ghrelin-F（10μmol/l） 0.4 Ghrelin-R（10μmol/l） 0.4 MgCl2（25mmol/l） 0.6 Total Volume 10 四、 PCR产物的分离，回收和纯化 相关试剂：胶回收试剂盒 相关仪器：（紫外照胶仪，移液器（200μl，1ml规格），离心机，恒温金属浴，涡旋混匀仪，制冰机，超微量分光光度计）

相关耗材：（切胶刀片，吸头，离心管架） PCR反应得到目的条带后，加大反应体积，然后根据胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收纯化。将所得DNA贮存于-20℃。

五、 目的片段与载体的连接 相关仪器：（恒温金属浴，移液器（10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）

按照连接试剂盒(TAKARA公司)说明书进行操作。 pMD-18T载体 1μl DNA 2μl ddH2O 2μl 然后加入5μl Ligation Mix，4℃/16℃放置 过夜连接。

六、 转化 相关仪器：（超净工作台，离心机，恒温培养箱，恒温摇床，恒温金属浴/水浴锅，移液器（1000μl，100μl，10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）

 CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞

全过程冰上进行，4℃离心，无菌操作。 （1）以接种环从-80℃保存的高效转化菌种蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12h； （2）挑取单菌落接种于1ml无抗生素LB培养基中，37℃剧烈震荡培养6h； （3）按1:100接种菌液于25ml LB液体培养基中，37℃震荡培养1.5～2h，至OD600达0.4～0.6；（这一步非常关键，培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA的能力较低，从而导致转化率降低） （4）冰上预冷10min；然后4℃，6000rpm离心10min； （6）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于25ml预冷的0.1M CaCl2中，冰浴20min； （7）4℃，6000rpm离心10min，弃尽上清； （8）以1.25ml（菌液体积的5%）预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入0.3ml预冷的100%甘油（甘油终浓度达15～20%），混匀后按每支100μl在冰上分装。-80℃保存备用。  连接产物转化到感受态细胞 （1）将10μl连接产物加入100μl感受态菌液中，冰上放置30min； （2）然后放到42℃水浴锅中热激90s，再在冰上放置3min； （3）加入890μl LB液体培养基，37℃震荡培养60min； （4）每个培养平板中加入40μlX-gal和4μlIPTG，然后吸取100μl菌液，均匀涂布于含Amp的LB固体培养基平板上； （5）37℃培养箱中正放1h，待菌液被琼脂完全吸干后，倒置平板，过夜培养16h。（培养时间不宜过长，否则有卫星菌落产生） 七、 菌液PCR检测 相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，涡旋混匀仪，移液器（10规格，1000μl规格），100μl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）

在平板上挑取10～20个白色菌落，加入含有1ml Amp+LB液体培养基的1.5ml离心管中，37℃震荡培养6h。3000rpm离心3min后吸掉上层400μl上清液，短暂涡旋将沉淀打散，然后把菌液当成模板，按上面PCR方法进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的条带。挑选扩增出正确目的条带的菌液送公司测序。

附注： 主要溶液和培养基的配制 1）电泳缓冲液10×TBE：108g Tris碱，55g 硼酸，20ml 0.5M的EDTA，加入蒸馏水混匀后定容至1000ml，调节pH为8.0； 2）LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g；加800ml去离子水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1000ml，高压（1.034×100000Pa）灭菌20min，4℃保存； 3）LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%，高温、高压灭菌20min后降温至50~60℃，在无菌状态下铺制平板，室温放置过夜后，置于4℃保存； 4）氨苄青霉素贮存液：用无菌双蒸水配成100mg/ml，分装，-20℃保存。使用时终浓度为100ug/ml。 5）用于制备感受态细胞的CaCl2（0.1mol/l）：称取0.56g CaCl2（无水，分析纯），溶解于50ml双蒸水中，定容至100ml，高压灭菌； 6）X-gal（20mg/ml）的配制：将20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存； 7）IPTG（200mg/ml）的配制：将0.2gIPTG溶于1ml去离子双蒸水中，0.22μm滤膜除菌，-20℃保存备用； 3’RACE （dT）17-接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CGA(T) 17 3’ 接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CG 3’ 1. cDNA的合成 DEPC水 9.75μl Oligo dT 接头引物 1μl Total RNA 2μl (<1000ng) 65℃,5min；立即置于冰上。 第一步变性后的RNA溶液 12.75μl 5×RT Buffer 4μl dNTP Mixture（各10mM） 2μl Rnase Inhibitor（40U/μl） 0.25μl Rever Tra Ace 1μl 总体积 20μl 反应条件：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。 2. cDNA的纯化 利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。最后使用20μl TE洗脱沉淀。 3. 第一轮PCR cDNA 1μl 10×Buffer 1μl dNTP（10mmol/L） 0.2μl Oligo dT 接头引物(10μmol/L) 0.4μl 3’RACE外引物(10μmol/L) 0.4μl Taq酶(1U/μl) 0.4μl MgCl2（25mmol/L） 0.6μl ddH2O 6.0μl 反应条件：降落PCR。 PCR产物稀释10倍作为模板进行下游实验。 4. 第二轮PCR cDNA 1μl 10×Buffer 1μl dNTP（10mmol/L） 0.2μl 接头引物(10μmol/L) 0.4μl 3’RACE内引物(10μmol/L) 0.4μl Taq酶(1U/μl) 0.4μl MgCl2（25mmol/L） 0.6μl ddH2O 6.0μl 反应条件：降落PCR。