核酸类药物生产工艺
类药物
三磷酸腺苷生产工艺
2、以兔肌肉为原料
⑤除热原、杂质 将洗脱液按总体积计加入0.6%的硅藻土,0.4%的 活性炭搅拌10min,用4号垂熔漏斗过滤,收集ATP滤液。
⑥结晶、干燥 用6M盐酸调滤液至pH2.5—3,在28℃的水浴中恒温, 加乙醇,不断搅拌,使ATP二钠结晶,用4号垂熔漏斗过滤,分别用 无水乙醇、乙醚洗涤,收集ATP二钠结晶,置五氧化二磷干燥器内 真空干燥,即得ATP成品。次滤液,冷处静置3h,经布氏漏斗过滤 至澄清,得提取液。
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生物制药工艺学——核酸类药物概 述
核酸是由许多核苷酸以3’, 5’-磷酸二酯键连接而成的大分 子化合物。核苷酸由碱基、戊糖 和磷酸三部分组成,碱基和戊糖 组成的单元叫核苷。核酸类药物 包括核酸、核苷酸、核苷、碱基 及其衍生物。 依据化学结构和组成分四大类:
1 核酸碱基及其衍生物 2 核苷及其衍生物 3 核苷酸及其衍生物 4 多核苷酸
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生物制药工艺学——核酸类药物
三磷酸腺苷生产工艺
1、化学结构和性质
白色类白色粉末,易溶于水, 难溶于有机溶剂。在水中的 溶解度具有氢型>钠盐>钡 盐>汞盐的顺序。在碱性溶 液(pHl0)及低温下比较稳定。 ATP二钠是两性化合物。能与 可溶性汞盐和钡盐形成不溶 于水的沉淀物,利用这种性 质可分离ATP。
生物制药工艺学——核酸类药物
核酸类药物 基本概况 核苷酸生产工艺 三磷酸腺苷生产工艺
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生物制药工艺学——核酸类药物概 述
核酸类药物分为两类:一类为具有天然结构的核酸类物质, 这类药 物已广泛用于放射病(Co60)、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝 炎、心血管疾病等,属于这一类的核酸类药物有ATP、辅酶A、脱氧 核苷酸等。第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合 物,这类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段,也是 产生干扰素、免疫抑制的临床药物,主要有三氟胸苷、叠氮胸苷、阿 糖腺苷等。
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生物制药工艺学——核酸类药物
三磷酸腺苷生产工艺
2、以兔肌肉为原料
(1)工艺路线
强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂
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生物制药工艺学——核酸类药物
三磷酸腺苷生产工艺
2、以兔肌肉为原料
①兔肉松的制备 ②提取 取肉松加入4倍量冷蒸馏水,搅拌提取30min,过滤后再提取1次。合并2次
(1)酶水解 最常用的酶有桔青霉A.S3.2788产生的5’—磷酸二酯酶,也 可用红酵母发酵所产生的3’—磷酸二酯酶。
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生物制药工艺学——核酸类药物
核苷酸的制备
(2)碱水解法
在 稀 碱 条 件 下 , RNA 容 易 水 解 得 到2’—核苷酸和3’—核苷酸。实际 上这是由于稀碱水解过程中,先 形成一个中间环状物2’,3’环状核 苷酸,它很不稳定,进一步水解 生成2’和3’—核苷酸。 稀碱水解的浓度随温度和作用时 间的不同而异。用1M氢氧化钾或 氢 氧 化 纳 在 80℃ 下 作 用 1h 能 使 RNA水解成单核苷酸;用0.3M氢 氧化钾或氢氧化纳在37℃下作用, 要16h。
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生物制药工艺学——核酸类药物
三磷酸腺苷生产工艺
三磷酸腺苷是体内广泛存在的辅酶,是体内组织细胞所需能 量的主要来源,蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需ATP参与 。ATP经腺苷酸环化酶催化形成环磷酸腺苷(cAMP),是细胞内的 生物活性物质,对细胞许多代谢过程有重要的调节作用。
ATP为蛋白质、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量,促 使肝细胞修复和再生,增强肝细胞代谢活性,对治疗肝病有较 大针对性。但外源性ATP不易进入细胞,且与体内需要的量比较 ,可能提供的量微不足道。
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HO 5
OH
CH2 O
4 H3 H 1
H OH 2OHH
β-D-核糖
腺嘌呤(A)
(U)
HO 5
OH
CH2 O
4 H3 H 1
H OH 2H H
β-2-D-脱氧核糖
鸟嘌呤(G)
(T) (C)
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生物制药工艺学——核酸类药物
核苷酸的制备
核酸(RNA主要存在于微生物中,如啤酒酵母、纸浆酵母以及 多种抗生素的菌丝体;DNA主要存在于动物内脏等)经酶、酸、 碱水解生成核苷酸,然后分离提取制备各种核苷酸的方法通称 水解核酸法。用催化剂的不同,分为酶水解、酸水解和碱水解 等。
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生物制药工艺学——核酸类药物
三磷酸腺苷生产工艺
3、产氨短杆菌直接发酵法
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生物制药工艺学——核酸类药物
三磷酸腺苷生产工艺
3、产氨短杆菌直接发酵法
①菌种培养 培养基组成葡萄糖10%,硫酸镁1%,尿素0.3%,玉米浆适量, 磷酸氢二钾1%,磷酸二氢钾1%pH7.2,接种量7—9%,pH控制在6.8— 7.2。
反义核酸技术及反义药物:反义技术是用人工合成的或生物中自然 存在的寡聚核苷酸片断(反义DNA和反义RNA),结合目标基因或 mRNA特定序列(靶核酸),从而有效地抑制或封闭基因的转录与翻译。
反义药物能与特定基因杂交,在基因水平干扰致病蛋白的产生过程, 即干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。
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②发酵培养 培养温度30℃,36h,投入腺嘌呤,加尿素、氢氧化钠和氨, 控制pH。通风量1:0.5v/(v·min)。
③提取、精制 发酵液加热使酶失活后,调节pH3—3.5,过滤,分离除去 菌体,上清液通过769活性炭柱吸附,用氨醇溶液洗脱,洗脱液再用CL型阴离子交换树脂吸附ATP,经氯化钠—盐酸液洗脱.洗脱液经醇沉, 过滤,丙酮洗涤,脱水,置五氧化二磷真空干燥器中干燥,得ATP品。
滤液,冷处静置3h,经布氏漏斗过滤至澄清,得提取液。 ③吸附 取处理好的氯型离子交换树脂装入层析柱,用pH3的水将柱平衡。
提取液上柱流速控制在0.6一1ml/(cm2.min)左右,吸附ATP。上柱过程 中用DEAE—C薄板检查。
④洗脱饱和ATP柱,用pH3、0.03M氯化钠液洗涤柱上滞留的AMP、ADP 及无机盐等,流速控制在1mL/(cm2.min)。再用pH3.8、1M氯化钠液洗 脱 ATP , 流 速 控 制 在 0.3ml/(cm2.min) , 收 集 洗 脱 液 。 操 作 温 度 在 0 一 10℃。