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高效液相色谱法在药典中的应用
项目 含量测定
2000版 109
2005版 527
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HPLC与TLC比较(2005版)
含量测定
TLC-SC
药材和提取物 15
中成药
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HPLC 175 352
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HPLC在中药质量分析和检测中的应用
有效成分、指标成分的检测； 杂质或有关物质检查； 添加物或有害残留物质的检测； 中药指纹谱分析
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高效液相色谱仪器
1. 储存和输送液体设备 2. 进样系统 3. 柱系统 4. 检测器 5. 控制和数据处理系统
选择流动相的原则： •保持色谱柱的稳定性 •化学惰性 •适合所用的检测器 •对样品有一定的溶解能力 •清洗、更换方便、毒性小 •沸点、粘度等物理性质合适
反相色谱最常用的流动相： 水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。 水－甲醇体系：大约50％水的时候粘度最大 水－乙腈体系：35％水的时候粘度最大。
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用一个式子表示如下：
X m nM s 吸附 X s nM m
解吸
X表示溶质分子，下标m为流动相，s为固定相 M表示流动相分子，下标m为流动相，s为固定相 n为被溶质分子取代的流动相分子数目
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键合相液相色谱
键合相固定相：在硅胶的表明用键合反应 把官能基团键合到表面上，解决固定相流 失的问题。
• 平板色谱（平面色谱） • 柱色谱
按分离的压力
• 高压液相色谱（高效液相色谱） • 中压液相色谱 • 常压液相色谱
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H－dp关系图
液固色谱法
一般也把吸附色谱法称为液固色谱法。液固色 谱法的固定相一般为固体吸附剂，常用的是： 碳酸钙、硅胶、氧化铝、氧化镁、活性炭等。 其中硅胶最为常用。
PDA 可以辅助定性。
DAD检测器3D图
示差折光检测器（refractive index detector RID）： 溶液的折射率等于溶剂及其中所含各组分 溶质的折射率与其各自的摩尔分数的乘积 之和。
RID是通用型的检测器，但是灵敏度不高。
RID不能用于梯度洗脱。
蒸发光散射检测器
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高效液相色谱仪器——泵系统
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进样系统包括手动进样和自动进样
无论手动进样还是自动进样，都要通过 六通阀。六通阀进样是高压系统的需要， 既不影响系统的正常运行又能够让样品 进到系统中去。
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高效液相色谱仪器——进样器
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柱系统包括色谱柱和柱温箱
正相色谱：流动相极性比固定相极性小
反相色谱：流动相极性比固定相极性大
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高效液相色谱——固定相 化学键合相硅胶
octadecyl
Si-[CH2]17-CH3 C18
octyl
Si-[CH2]7-CH3 C8
cyanopropyl Si-[CH2]3-CN
CN
aminopropyl Si-[CH2]3-NH2 NH2
高效液相色谱法 及其在中药分析中的应用
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色谱分离
慢 中等
快
淋洗液
Temporal course
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液相色谱的分类
按溶质在分离过程中的原理：
• 吸附色谱 • 分配色谱 • 离子交换色谱 • 体积排阻色谱 • 亲和色谱
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液相色谱的分类
按色谱固定相的形式：
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高效液相色谱仪器——检测器
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紫外吸收检测器有三种类型： 固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定 254nm或280nm紫外光。
可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光
光二极管阵列检测器photo－diode－array detector（PDAD，PDA, DAD）：钨灯和氘灯组合 光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外 波长上的光。
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电学和电化学检测器：
安培检测器 电导检测器 库仑检测器 介电常数检测器 极谱检测器
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工作站： 完成数据采集和对仪器的控制。
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超高效液相色谱仪（ UPLC）
超高效液相色谱是分离科学 中的一个全新类别，它给实 验室带来了新奇而强大的能 力。UPLC™借助于HPLC的 理论及原理，涵盖了小颗粒 填料、非常低系统体积及快 速检测手段等全新技术，增 加了分析的通量、灵敏度及 色谱峰容量。
吸附色谱对中等分子量的油溶性样品可获得最 佳的分离，而对强极性或离子型的样品，有时 会发生不可逆吸附，不能得到满意的结果。
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基本原理：
吸附剂一般为多孔性的物质，在它们的表明 存在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相 分子在吸附剂表面的活性中心上进行竞争， 同时不同溶质之间和同一溶质的不同官能团 之间液也存在竞争。竞争的综合结果就是形 成不同溶质在吸附剂表面吸附、解吸平衡。
存放流动相的容器一定要惰性的，并且 有机溶剂要避光。
输液泵要求流量平稳,可以调节的流量 范围宽，耐高压。
一般是柱塞往复泵。
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流动相的混合输入和洗脱方式
离线混合 配制 滤过 脱气
在线混合 低压在线混合 高压在线混合
洗脱 等度洗脱 梯度洗脱
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固定相的其他性能
载体的形状 球形 无定形 粒径 3~10μm, 1.7~2.5μm 孔径 <150Å 分析分子量
<2000的化合物;>300Å 分 析分子量>2000的化合物 表面积 键合基团的表面覆盖度 含碳量
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一般认为键合相色谱的机理分配色谱机理， 也有人认为它是吸附色谱机理，其实应该 是有两种成分在里面，现在又有疏溶剂理 论等机理的提出。
反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱， 也就是C18柱。 柱温箱的温度控制要求比较精/12
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液相色谱检测器
测量原理不同分类： •光学性质检测器 •电学和电化学性质检测器 •热学性质检测器
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光学性质检测器：
紫外－可见光检测器 示差折光检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 化学发光检测器