u 倒掉上清，加入750微升的wash buffer ,12000r/min离心1分钟； u 倒掉上清，重复步骤三；
u 倒掉上清，在12000r/min下空转1分钟；
u 把带有膜的管子换到新的EP管中，加入30~50微升的水，静置1分钟， 12000r/min离心一分钟，即得到所要回收的片断。此样品可用来做酶 切等。
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u 电泳染色后，在紫外分析仪上切取所需要的条带，按1克胶：1000添加
ØIV. DNA片段的体外重组
心，用封口胶封口。
u 将EP管放入金属浴当中37度酶切两个半小时左右，取出酶切产物，用 试剂盒进行割胶回收进一步纯化酶切片断以进行连接反应。 酶切体系： 40.0ul ddH2O 9.0ul 连接体系： （20.0ul） 10×Buffer 4.0ul 酶切产物 3.0ul DNA 25.0ul Buffer 1.0ul Xba I、 1.0ul 载体 14.0ul Hind III 1.0ul Liagse 2.0ul u 连接反应：
限制性核酸内切酶酶切分离法简单基因组分离如质粒和病毒
目的基因制备
基因定位克隆 酵母双杂交
载体选择
体外扩增PCR
互补性黏性 DNA重组片段连接 不互补性黏性 末端 平末端 前处理防止自连
RNA提取
RT-PCR
TA克隆
蓝白选择
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表达引物PCR 载体 胶回收 PCR产物回收 转化感受态细胞
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具体实验步骤
Ø Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增
Ø Ⅲ. DNA的琼脂糖凝胶上回收与纯化 Ø IV. DNA片段的体外重组与转化 Ø V. 克隆的筛选与鉴定 Ø VI.序列分析
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利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出目标基因
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一、实验起始材料的选取和准备
人工气候箱、制冰机
超净工作台、显微操作系统
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分离准备工作 水稻卵细胞的分离 材料的速冻 长期保存
RNase 抑制剂
RNase-free 耗材、液氮罐
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Ø V. 克隆的筛选与鉴定
试剂盒质粒回收过程
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把过夜培养菌液，10000r/min离心1分钟，倒掉上清液； 向菌体中加入质粒回收试剂盒中的SolutionI400微升，震荡，直到沉淀 的菌体完全悬浮； 然后加入400微升的SolutionII，轻轻地颠倒混匀，然后在室温下放置2 分钟； 加入525微升的SolutionIII，颠倒混匀，直到出现白色的絮状沉淀， 10000r/min离心10分钟； 把上清液转移到试剂盒专用管中，10000r/min离心1分钟; 倒掉溶液，向管子中加入600微升的buffer HB，10000r/min离心1分 钟； 倒掉溶液，加入750微升的wash buffer, 10000r/min离心1分钟; 重复上一步骤7次； 倒掉溶液后空转一次，以尽量除尽残余的wash buffer ; 将带有膜的管子转移到新的EP管中，加入100微升的水，静置1分钟， 10000r/min离心1分钟，即得到所需要的质粒。
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Ⅲ. 琼脂糖凝胶上DNA的回收与纯化
提取缓冲液，放在60度的金属浴中溶解。然后把溶液转移到试剂盒专 用管中，6000转/分离心1分钟；
u 倒掉上清，再加入500微升的extraction buffer,12000r单个未知基因在整个基因 组中的比例很小且不能在体外特异性扩增，所b 心 bi oo 做 .c 生 om 物
油菜TOC33基因片的克隆
u 实验项目背景 国家自然科学基金项目（油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克 隆，编号：30170500）。 u 实验目的 通过本综合实验，掌握植物基因组DNA的制备技术、PCR技术、限制性 内切酶酶切技术、重组DNA技术、克隆鉴定技术、质粒DNA的制备、琼脂 糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等，得到一个与科学研究过程 相近的分子生物学综合技能训练。
Ø Ⅰ.植物基因组DNA的制备
Ⅰ.植物基因组DNA的制备
分捣碎，加入0.6mL 抽提缓冲液，65℃水浴处理10min。 u 12,000rpm离心3min，取上清，加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀，遇有 絮状沉淀，4,000rpm离心5min。 u 沉淀用50ul TE-RNase（5.0mM Tris.HCl pH 8.0，1.0mM EDTA pH 8.0， RNase A 30ug/mL）溶解，37℃保温处理15min。 u 加 入 二 倍 体 积 预 冷 的 无 水 乙 醇 ， -20℃ 下 沉 淀 10min ， 4,000rpm离 心 3min，加适量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37℃烘干，加入50ul ddH2O 溶解备用。
超低温冰箱
二、卵细胞mRNA的提取、纯化
旋涡混匀器 离心机
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细胞裂解 匀浆 去蛋白和细胞残渣 温浴并结合 洗脱 去盐和回收
200℃ 烘箱
Oligotex系列试剂盒
DEPC 、 RNase-free DNase I 、 RNase-free 耗材
获得的阳性单克隆送样测序，测序结果的同源性比较采用 GenBank中的BLAST分析程序，基因序列比较运用DNAsist软件。
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Ø VI.序列分析
• 实验起始材料的选取和准备 • mRNA的提取、纯化 • • • •
目标片段的克隆和分析 DNA、RNA的提取、纯化和分析 克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析 基因转化实验及转基因结果分析
恒温水浴锅
பைடு நூலகம்
离心机、旋涡混匀器
三、目标片段的 • 目标基因的获得； • 通过噬菌体载体自切割或T-Vector、平末端载体 克隆获得目标质粒； • 利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序；
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1.通过SMART技术构建cDNA恒温水浴锅、制冰机 PCR仪
恒温水浴锅、离心机
电泳仪器、凝胶成像系统 恒温水浴锅
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第一链的合成 第二链的合成和扩增 酶切、纯化和e、RNase抑制剂
高保真Taq酶
限制性内切酶、过滤柱 琼脂糖
超净工作台、烘箱、PCR仪 超低温冰箱
培养基
DMSO
2.目标基因的克隆
ü 将培养于平板的噬菌斑通过印迹转于尼龙膜，并于核酸交联仪中固定。在杂 交箱中利用特定探针杂交。最后在恒温摇床中洗膜（探针标记：放射性和非 放射性） ü 将噬菌体培养于平板，于42℃培养几小时后，于37℃用IPTG诱导融合蛋白的 表达并印记于尼龙膜上，利用抗原-抗体反应进行杂交
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u 取0.2g样品嫩叶至1.5mL EP管中，放在液氮中冷冻处理后，在EP管中充
Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增
u 引物设计，为扩增Toc33片段，用OLIG05. 0设计1对PCR引物: 上游引物P1: 5'一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3'， 下游引物P2：5'一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3'。 u 在0.2mLEppendorf管内配制25ul反应体系： 10×PCR Buffer 2.5 ul Mg2+ 1.5 ul dNTP 1.0 ul 1) 94 oC 预变性 5 min Primer 1 1.0 ul 2) 94 oC变性 30 sec Primer 2 1.0 ul 3) 55 oC退火 30 sec Taq 酶 0.5 ul 4) 72 oC延伸 45 sec 模板 1.0 ul 5) 重复步骤2)-4)30次 ddH2O 16.5 ul 6) 72 oC延伸10 min
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u 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 1) 称取0.5g琼脂糖放入溶胶瓶中，再加入1ml 50×TAE缓冲液，49ml 高 水，置微波炉或水浴加热至完全融化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶 液。 2) 取电泳槽里面的胶板，用胶带将两端封好，调平，并放好样品梳子。 3) 将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入胶板，直至胶板上形成一层 均匀的胶面。 4) 待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。 5) 用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。 6) 接通电泳槽和电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移 动）；选择合适的电压，开始电泳； 7) 当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1－2cm处，停止电泳。 8) 将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色10min后取出，用清水冲洗。 将胶放于凝胶成像系统内拍照，以观察样品在琼脂糖凝胶中的带（EB有 剧毒，戴手套操作）。
1. 用移液枪在1.5mlEP管中加入液体LB培养基500ul，再用灭过菌的牙签
在生长蓝白斑的平板上挑取阳性克隆放于EP管中，丢弃牙签，盖紧 管口，用报纸包好放到37OC，200r/min的摇床中过夜培养； 2. EP管出现混浊，用质粒提取试剂盒提取质粒。 3. 对于得到的质粒再酶切电泳检测阳性克隆，如果酶切后的电泳图上 出现了与插入片断相应大小的条带，证明是此单菌落是阳性克隆， 否则是假阳性的。