基因工程实验指导书缩略词表实验一植物总DNA 的抽提及电泳检测一【实验目的】1、了解植物DNA抽提的主要方法；2、掌握快速抽提DNA的方法。

3、了解掌握检测DNA质量的方法以及DNA定量的方法；4、了解影响DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素；5、训练DNA的琼脂糖凝胶电泳操作。

二【实验原理】该方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。

CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。

CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。

经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。

再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

CTAB能溶解于乙醇。

改进的CTAB植物DNA抽提液迅速裂解细胞和灭火细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白质，上清加入异丙醇离心沉淀基因组DNA，进一步去除其它各种杂质，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心步骤，进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯化的重要实验手段。

DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。

一般情况下，单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。

DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。

具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。

溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，在紫外光照射下可发出波长590nm的红色荧光，DNA分子与EB形成荧光络合物后，其发射的荧光比原来要增强数十倍，常用来观察凝胶中DNA 条带的位置。

三【试剂】试剂盒(Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3、RNase A、漂洗液WB、洗脱缓冲液EB、吸附柱AC、分离柱A、收集管)、、70％乙醇、无水乙醇、β-巯基乙醇、溴化乙锭(EB)；TE缓冲液(含10 mmo1/L Tris和1 mmo1/L EDTA，pH 8.0，高压灭菌)；琼脂糖凝胶(0.7～1.5%，琼脂糖粉末与1×TAE配成)；TAE(Tris-乙酸盐，EDTA)电泳缓冲液（50×浓缩贮存液）：Tris碱242g；冰醋酸57.1mL；0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 100mL；加600mL蒸馏水，剧烈搅拌，加蒸馏水至1000mL，浓盐酸调pH至8.0。

10×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、15%的Ficoll水溶液、0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0、1.0%SDS。

四【仪器设备及材料】1、仪器设备离心机、水浴锅、液氮罐、天平、研钵、EP管、微量移液器(20μL、200μL、1000μL)、刻度量筒、玻璃棒、三角烧瓶、移液枪及枪头、微波炉或沸水浴、凝胶灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝胶样品梳、稳压稳流电泳仪、紫外分析仪、数码相机、封口胶带和电源等。

2、材料植物叶片。

五【植物总DNA 的抽提步骤】*第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇！*将Buffer P1放置在65℃预热，使用前加入β-巯基乙醇到终浓度0.2%1、称取适量（每人取1g）叶片放入预冷的研钵中，加入适量液氮，迅速研成粉末，装入离心管中。

2、加热Buffer P1、研钵、研杵到65℃，65 ℃预热灭菌去离子水。

3、注意细粉(植物新鲜组织1g或干重组织300mg)到一个50ml离心管，不要解冻，迅速加入5.5ml 65 ℃预热Buffer P1(已经加入β-巯基乙醇到终浓度0.2%)和40ul RNase A 剧烈涡旋振荡混匀1分钟，室内放置10分钟。

4、加入1.3ml的Buffer P2，充分混匀，10000g以上离心10分钟。

5、小心吸取上清到一个分离柱A，注意不要洗到界面物质，4000rpm离心3-5分钟，收集下液。

6、加入1.5倍体积的Buffer P3立刻轻柔涡旋，充分混匀。

7、将上一部所得混合物(包括可能出现的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱加入收集管中)静置1分钟，12,000rpm离心10分钟，倒掉收集管中的废液。

8、将吸附柱移到新的收集管中并加入7ml漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12,000rpm离心5分钟，倒掉收集管中的废液。

9、重复8。

10、将吸附柱AC放回空收集管中，12,000rpm离心5分钟，尽量出去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11、去除吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1-2ml洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热，能提高洗脱效率)，室温放置5分钟，12,000rpm离心5-7分钟。

12、重复11换另外一个收集管收集DNA，第二次收集的产量比第一次低。

13、DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。

【琼脂糖凝胶电泳检测步骤】1、选择孔径大小适合的点样梳，垂直架在胶版的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为0.5-1mm。

2、称取0.25g琼脂糖，加入25ml 1×TAE电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解均匀。

3、于50ml的离心管中加入1.25μl EB (10mg/ml)。

4、待凝胶冷却至50℃左右，将凝胶倒入50ml离心管中。

5、将离心管中的凝胶溶液轻轻倒入电泳凝胶板上，除去气泡。

6、待凝胶凝固后，小心取出点样梳。

7、在电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，将胶板放入电泳槽中（点样孔一端靠近电泳槽的负极），使电泳缓冲液没过胶面。

8、待测样品中加入1/6体积的6×上样缓冲液，混合后，移液枪点样，记录样品点样顺序及样量。

9、连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色。

10、开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm。

11、当指示剂跑过胶板的2/3，可终止电泳；切断电源后，将电泳凝胶块放在凝胶成像仪中观察，拍照。

六【注意事项】1、尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10 mM的-ME处理。

2、所用试剂必需灭菌。

3、注意溴化乙锭(EB)是一种强诱变剂，有致癌嫌疑，操作过程戴手套和口罩，并注意把实验中沾染EB和未沾染EB的实验器具分开，防止EB交叉污染，万一接触了溴化乙锭，立即用大量的水冲洗。

4、配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。

因为pH或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，严重影响DNA片段的泳动。

5、微波炉加热时间过长，琼脂糖溶液会变得过热或剧烈沸腾。

应调整好加热所有琼脂糖颗粒完全溶解需要的最短时间。

6、溴酚蓝与0.5kb大小的DNA的泳动度相近，这可给泳动最快的DNA片段提供一个指示。

7、凝胶要用于印迹分析或将要回收DNA条带时，每个样品必须使用一个新的枪头。

8、影响DNA 的迁移率的因素：（1）DNA分子大小：DNA分子越小，迁移越快。

（2）DNA分子构象：共价闭环DNA>线形DNA>开环双链DNA。

（3）琼脂糖浓度：其浓度越低，迁移越快。

（4）两极间电压：电压越高，迁移越快。

9、DNA区带不清晰，有可能是点样量少或过大，但也有可能是电压过高、凝胶有气泡、凝胶孔破裂的原因。

10、为了消除RNA的影响，可以在电泳前加RNA酶(约每10μL DNA加1μL R NA 酶)，37℃水浴30min。

11、在进行电泳的过程中，溴酚蓝有可能会变黄，这是由于电泳液使用过久或残留在电泳液中的凝胶变质引起DNA 结构改变或丢失。

时常更换电泳液和刷洗电泳槽即可。

实验二大肠杆菌感受态细胞细胞的制备一【实验目的】学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法。

二【实验原理】在进行基因克隆时，体外构建的DNA重组子必须导入合适的受体细胞，才可以复制，增殖和表达。

裸露的外源DNA直接进入细胞体内称为转化。

载体与外源目的基因构成的重组载体可以通过转化直接导入受体细胞，从而实现基因在异源细胞的表达。

进行转化时，要求细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态，重组分子才能进入细胞内。

通过CaCl2处理的大肠杆菌细胞就是一种感受态细胞。

在0℃冷冻处理时，处于CaCl2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。

DNA可吸附于其表面。

在短暂的热冲击下，细胞吸收外源DNA，然后在丰富培养基内复原并增殖，表达外源基因。

带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内可表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。

三【试剂】1、LB 液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L 、酵母提取物5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L用NaOH调pH值至7.0，高压灭菌。

固体培养基需加1％琼脂粉。

2、0.05mol/L CaCl2溶液：称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。

3、含15%甘油的0.05mol/L CaCl2：称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml 重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。

四【仪器设备及材料】E.coli DH5α菌株、eppendorf管、恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、制冰机、分光光度计、微量移液枪、高压灭菌锅。

五【实验步骤】1、取大肠杆菌DH5α保存液50μl，接种于4ml LB（或SOB）液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养过夜，第二天取50μl转接到新的4ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。

2、4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。

3、加入750μl预冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min。

4、4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。

5、加入100μl 冰冷的0.1M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4℃保存备用。

六【注意事项】1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。