生物化学实验安排实验一蛋白质及氨基酸的呈色反应一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、实验原理1. 双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。

2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。

3.苯环的黄色反应Tyr+ 浓硝酸黄色TrpPhe+少量浓硫酸+浓硝酸黄色4. 乙醛酸的反应：检测Trp或含Trp蛋白质的反应。

当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中滴加时，产生分层现象，界面出现紫色环。

主要是由于蛋白质中的吲哚环作用。

5. 偶氮反应偶氮化合物都含有-N=N-这样结构，通常作为染料。

6. 醋酸铅反应()↓--→+--+Pb COO NH Pb COOH N H 2222Pr Pr三、实验步骤1. 双缩脲反应(biuret reaction)取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清：水= 1：9）约1ml 和10%NaOH 约2ml ，摇匀，再加1%CuSO4溶液2滴，随加随摇。

观察现象，记录。

2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction)（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液（蛋清：水= 1：9）和甘氨酸溶液1ml ，再各加0.5ml0.1%茚三酮，混匀，沸水浴中加热1-2分钟，观察颜色是否由粉红色变紫红色再变蓝色。

（2）在一块小滤纸上滴1滴0.5%的甘氨酸溶液，风干后再在原处滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察是否有紫红色斑点的出现。

3. 苯环的黄色反应向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。

鸡蛋清溶液（蛋清：水= 1：9）4. 乙醛酸的反应：向3个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。

蛋白质溶液（蛋清：水= 1：20）5. 偶氮反应向3个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。

鸡蛋清为纯蛋清。

6. 醋酸铅反应取1支试管，加入10%醋酸铅溶液1ml，再加入10%NaOH至产生的沉淀完全溶解为止，摇匀。

加入被水稀释一倍的蛋白质溶液0.4ml.混匀,小心加热,至溶液变黑后,加入浓盐酸数滴,嗅气味,并将湿润的醋酸铅试纸置于管口,观察其颜色变化,记录。

（蛋白质溶液为蛋清：水= 1：1）四、注意事项1、实验内容繁多，请认真预习、操作。

2、操作请按步骤进行五、问题讨论1、如果茚三酮反应呈阳性，结果颜色为何？能否用茚三酮反应可靠鉴定蛋白质存在？2、黄色反应得阳性结果说明什么问题？3、为什么蛋清可作为铅或汞中毒的解毒剂？实验二氨基酸单向纸层析一、实验目的：1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层析的原理和操作技术；2、掌握分配层析法；3、掌握影响分配系数的因素。

二、实验原理:纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。

由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。

缺点是展开时间较长。

分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。

在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。

溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。

移动速率：Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。

影响Rf值的主要因素：Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。

由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以主要决定于分配系数。

不同物质分配系数不同，Rf也就不同。

（1）物质的结构和分子极性：结构不同极性不同，在两相中的溶解度也就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之Rf则较大；（2）层析溶剂：首先，溶剂的纯度要高，否则需经预先处理（酸碱抽提，重蒸馏，脱水干燥等）；其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf在0.05～0.85，样品被分离物质的组分的Rf之差最好大于0.05。

再次，有些溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇-甲酸-水系统久放易引起酯化；最后，溶质和溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响很大；（3）pH值：溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf改变；溶剂的pH还可以影响流动相的含水量，溶剂的酸碱度大，吸水量多，使极性物质的Rf增加（将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理）；（4）滤纸：层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂所饱和。

不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合水的量不一样，两相的体积比也就不同，Rf也不同；另外，滤纸的杂质也会影响Rf，必要时进行预处理（可用0.01～0.4M的HCl处理除去金属离子）；（5）室验室的温度和时间:温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用，影响固定相的体积；也显著地影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例，层析必须在恒温条件下进行，某些对温度敏感的溶剂系统，最好不配制成饱和溶液。

层析时间长Rf大。

（6）展开方式：下行法（层析缸上部有一盛展开剂的液槽,滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易扩散）Rf大，上行法Rf小；环行法（最好用无方向性的特制滤纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf较小。

（7）样品溶液中杂质：如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。

三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸标准品2、仪器：(1)毛细管(2)电热吹风机(3)层析缸(4)层析滤纸（5）小型玻璃喷雾器（6）铅笔、直尺等。

3、试剂：（1）氨基酸标准溶液：赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸标准品。

（2）溶剂系统：正丁醇：冰乙酸：水=40：10：30 (体积比）摇匀，取上层清夜；（3）0.1%的水合茚三酮溶液。

四、实验步骤：1、样品的准备：（实验室准备）2、滤纸的准备：取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个“+”作为点样位置，共4个点。

3、点样：用毛细管点样，中间的点混合氨基酸，两侧点三种标准氨基酸；每个点样点重复点2次，每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用定书针将滤纸做成筒形，点样面向外,注意纸的两边不要接触。

4、展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线，（高约1.5cm，约50－60ml溶剂）将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，冷风吹干。

5、显色：用喷雾器将0.1％茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，热风（加快反应）反应吹干显色。

五、实验结果与计算：1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来。

2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf值。

3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。

六、思考题：1、分析影响移动速率的因素有哪些？2、何谓分配层析法和分配系数？实验三 蛋白质两性解离与等电点测定一、 实验目的1、了解蛋白质的两性解离性质。

2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。

二、实验原理蛋白质分子中仍然存在游离的氨基和游离的羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质。

pI 概念：当蛋白质溶液处于某一pH 时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点。

pI 是蛋白质的特征性常数。

利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。

最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH 值。

本实验借观察在不同pH 溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。

用醋酸与醋酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH 值的缓冲液。

向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH 值即为酪蛋白的等电点。

三、实验试剂与器材 1、试剂乙酸(1mol/L 、 0.1mol/L 、 0.01mol/L) 0.2mol/LNaOH; 0.2mol/LHCl;0.5%酪蛋白溶液;0.01%溴甲酚绿指示剂; 酪蛋白-乙酸钠溶液 2、器材试管、移液管 四、实验步骤PrNH 3+COOHPr NH 3+COO -Pr NH 2COO --OH -H+兼性离子pH=pI阳离子pH<pI阴离子pH>pI1、蛋白质的两性反应1ml 0.5%酪蛋白+4d0.01%溴甲酚绿先滴加0.2mol/l HCl溶液，观察溶液颜色变化，并记录；然后再滴加0.2mol/l NaOH溶液，观察溶液颜色变化，并记录现象。

2、酪蛋白等电点的测定（1）不同pH环境条件的营造（2）向上述7支试管中各加1ml酪蛋白乙酸钠溶液，混匀，静置5min，观察各管浑浊度，用+、±、－等符号表示浑浊度，并判断酪蛋白等电点。

五、实验记录1、蛋白质的两性反应结论：2、酪蛋白等电点的测定结论：六、思考题1、如何根据实验现象判断酪蛋白的等电点？为什么？2、如何根据以上实验现象确定制备酪蛋白路线?实验四牛乳中酪蛋白的制备一、实验目的学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。

二、实验原理牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。

酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。

利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调到4.7时，酪蛋白就沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。

三、实验仪器与试剂1、仪器离心机，抽滤装置，精密pH试纸或酸度计，电炉，烧杯，温度计2、试剂（1）95%乙醇；无水乙醚；乙醇-乙醚混合液（体积比1:1）（2）0.2mol/LpH4.7 醋酸—醋酸缓冲溶液3000mL（先配制A液与B液）A液：（0.2mol/L醋酸钠溶液）：称NaAC·3H2O54.44g，定溶至2000mL。

B液：（0.2mol/L醋酸溶液）：称优级纯醋酸〈含量大于99.8%〉12.0g定溶至1000mL。

取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸—醋酸缓冲溶液3000mL。

3、材料牛奶五、实验操作1．将25mL牛奶加热到40℃。