第八章 酶的定向进化
• • 第一节 定向进化简介 第二节 定向进化的应用
第一节 定向进化简介
• • • • 一．理论来源 二．概念 三．定向进化的选择策略 四．杂合酶
一．理论来源
• 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生 物进化过程
– 化学进化 – 生物进化
二．概念
• 酶分子改造,基于序列的合理化设计， sequential rational design
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化，非合理设计 irrational design
酶分子的合理设计： 酶分子的合理设计： • 利用各种生物化学，晶体学，光谱学等方 法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶 的分子特征、空间结构、结构和功能之间 的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造。 酶分子的非合理设计： 酶分子的非合理设计： • 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机 突变，基因重组，定向筛选等方法对其进 行改造。
• functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purification
Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52
酶分子存在进化潜力的原因
1.天然酶在生物体内存在的环境和酶实际应 用的环境的不同。如非水相作为筛选压力。 2.生命体内的单个酶的进化受到整体调节， 进化机会有限。 3. 非生物体内所涉及的酶或蛋白质的性质， 如蛋白类药物改造消除其副作用。
三．定向进化的选择策略
定向进化=随机突变 正向重组 选择（或筛选） 定向进化 随机突变+正向重组 选择（或筛选） 随机突变 正向重组+选择 – 关键：突变和筛选 – 突变，采用回交法消除不利突变和中性突变 – 筛选，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质有 关。 例：蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X 光片消化分析，44000个突变株筛选
O OH OH O
lipase lipB68
R R
O
+
R
R=CH3, and CH2CH3
O
Reaction system contained: 0.5mmol of racemic α-phenylethanol or α-phenylpropanol dissolved in 10ml toluene containing 1mmol of vinyl acetate, with 0.5g immobilized enzyme added. Samples taken at 120hour and subjected to GC analysis.
Zhengbing Jiang, Yitao zheng, Yu Luo, Gang Wang, Hongping Wang, Yushu Ma and Dongzhi Wei*. Cloning and Expression of a Novel Lipase Gene From Pseudomonas fluorescens B52. Molecular Biotechnology. 2005 ( 31), 095-102.
• 定向进化：突变 定向进化：
筛选
突变位点是随机的，不确定的； 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
4. 外显子改组 在许多基因中，一个外显子编码一个折叠结 构域，内含子间的重组可使独立的外显子 组装成编码新蛋白质的基因，此过程即为 外显子改组，可导致蛋白质的快速进化。 外显子独立编码的模块组装。 外显子独立编码的模块组装。
5.计算机辅助设计 减少由于盲目随机突变形成的突变库容量过大而造 成的筛选困难。 6.突变库的构建和应用 例：噬菌体表位随机序列多肽库（phage display random peptide library) 合成随机序列寡核苷酸片段，克隆入表达载体表 达，表达产物以融合蛋白的形式呈现在活的丝状 噬菌体表面。肽库中包含了所有可能序列组分， 每一个噬菌体呈现一种肽段，库容量极大，易于 筛选和扩增。通过亲和筛选，可得到较高特异性 和亲和力的理想的目的肽段。
• p-nitrophenyl caprate as substrate. • Optimal temperature as 20°C ，50% activity at 0°C。
Relative Actity of lipB68
Model Reaction：Chiral resolution of α-phenylethanol and α-phenylpropanol via esterification.
成功实例
Lipase genes (lipB52, lipB68) isolated from Pseudomonas fluorescens B52、B68 B52、 AY623009、 Genbank Accssion number AY623009、AY694785
成功实例
Lipase gene (lipB52）expressed in Pichia pastoris KM71 lipB52）
定向进化示意图
随机突变+定向选择＝目标突变体 随机突变+定向选择＝ 最适生长温度提高了！ 最适生长温度提高了！
诱发突变 的因素
细菌
50 C培 养
0
最适生长温度 为37 C
0
突变体 库
选择压 力（温 度）
温度耐受型 突变体
Strategies for the development of effective enzymes
• 定点突变： 定点突变：
突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。 PCR技术为基础的 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。
Production of Biodiesel via Transesterification Catalyzed by Lipase B68
•Yield to 92% at 20°C and 24 ° hours with immobilized lipB68. •The lowest temperature reported previously.
Production of Biodiesel via Transesterification Catalyzed by Lipase B52
Transesterification between soybean oil and methanol. Conversion ＞90% at 40oC for 35 hours
酶分子的定向进化 directed evolution
– 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解 酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的 进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基 因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并 定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
澄清一个事实：定向进化不是定点突变 不是定点突变 澄清一个事实：定向进化不是
回交育种
回交是指两个亲本杂交后，杂种后代与亲 回交是指两个亲本杂交后， 本之一再次进行的杂交。 本之一再次进行的杂交。
A×B ↓ F1×A A称为轮回亲本、 B称为非轮回亲本 A称为轮回亲本、 称为轮回亲本 ↓ 受体亲本 供体亲本 BC1F1×A ↓ BC2F1×A ↓ ： ↓ BCnF1
回交育种是改进现有品种个别性状的一种方法。 回交育种是改进现有品种个别性状的一种方法。 当甲品种有许多优良性状，而存在个别缺点时， 当甲品种有许多优良性状，而存在个别缺点时， 可选择具有甲品种所需性状的乙品种与甲杂交， 可选择具有甲品种所需性状的乙品种与甲杂交， F1及以后各代均用甲进行一系列回交和选择， F1及以后各代均用甲进行一系列回交和选择， 及以后各代均用甲进行一系列回交和选择 使甲品种的原有性状得以恢复，同时获得了需 使甲品种的原有性状得以恢复， 要改进的性状。 要改进的性状。
Characterization of a psychrophilic lipase from Pseudomonas fluorescens strain B68
Hydrolyzation activity of lipase lipB68
120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperature (゜C)
Lipase R&D from uncultured microorganism
—— Lipase genes (lipJ02, lipJ03) expressed in Pichia pastoris KM71 (lipJ02, lipJ03)
Functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
Production of biodiesel from soybean oil by immobilized lipB68
Lipase R&D from uncultured microorganism
—— Lipase genes (lipJ02, lipJ03) isolated from environmental sample (lipJ02, lipJ03) Cloned with Genome-Walking. Genbank Accssion number AY673674、AY700013 、