△h = hV-hL，凝结或汽化潜热，1 Atmosphere = 1.013 bar = 14.71 psia
7
热力灭菌设备
过热水灭菌釜 干热灭菌釜 蒸汽灭菌釜

8
湿热灭菌工艺研发与确认
灭菌工艺的验证
工艺灭 法) 产品特异性 灭菌工艺
工艺确认阶段
微生物数量的对数值随灭菌时间的增加而减少
25
耐热参数D 值的定义

D 值指一定温度下，将微生物杀灭90％（即 下降一个对数单位）所需要的时间（Time for decimal reduction）
26
D T值的影响因素

..挑战微生物的种类 ..挑战微生物的贮存条件 ..挑战微生物的恢复生长和培养条件 ..灭菌釜的灭菌工艺温度 ..DT值测定开始前的起始温度 ..悬浮液和恢复生长用培养基种类 ..灭菌结束后的放置温度与时间 ..蒸汽的饱和度 ..原始包装材料
饱和蒸汽表 水-蒸汽系统处在饱和状态时的性质 温度℃ 100 115 120 121 125 压力Bar 1.013 1.692 1.987 2.026 2.322 焓（内部热量）J/g 水hL 419 483 504 508 525 △h* 2256 2216 2202 2199 2188 蒸汽hV 2675 2699 2706 2707 2713

14
药典要求

EP 对过度杀灭法的工艺要求： 对溶液的灭菌条件至少为121oC ×15 分钟； 也可采用其它组合条件，但灭菌效果须与上 述相等效。 目标：无菌保证值（SAL，污染概率的负对数） 大于等于12。
15
药典要求
USP 对过度杀灭法的工艺要求： 对溶液的灭菌条件需达到12D ，至少为12 分 钟。 设计目的： 使D121=1分钟，数量为106的微生物经过灭 菌后达到SAL= 10-6。
3

最终灭菌工艺的优点

制药工艺中常用的灭/除菌方式
热力灭菌


湿热灭菌 （118--134℃）--蒸汽、过热水 干热灭菌（160--320 ℃）--热空气


气体灭--环氧乙烷 离子辐射灭菌--γ 辐射和电子束辐射 过滤除菌法--过滤名义孔径小于等于0.2μm
4
热力灭菌的基本原理

21
灭菌工艺验证–PQ (二)
生物指示剂试验 – 结果与热穿透试验保持一致 – 所有测试点均应确保SAL 不低于6 – 试验次数足以符合统计学要求（至少重复3次 试验，指示剂数量10 – 20 支/次）。

22
再验证和变更管理
再验证 – 进行再验证的条件 设备、产品、工艺有重大改变，或设备有重大维修 定期的常规再验证（一次/12-24 月） – 验证方法 通常与初次PQ 方案相同。 变更管理 – 有相关SOP 来评价变更对工艺的潜在影响 – 根据变更评估结果确定再验证的范围
10 0.66 0.89 0.99
15 0.80 0.96
10
最终灭菌产品无菌的标准

通过物理/生物学方法证明，单位产 品内微生物存在的概率不超过百万 分之一(即批产品的污染概率不超过 百万分之一). – 可实现参数放行
11
影响灭菌效果的因素

物理化学条件
..环境因子 ..芽孢是否处于被包裹状态
20
灭菌工艺验证–PQ (一)
每种装载方式下的热穿透试验 – 证明特定灭菌程序杀灭微生物的均一性和有效性; – 重复性试验证明灭菌程序的重现性和稳定性; – 证明灭菌程序对被灭菌物品的相容性. 容器内部产品的热穿透试验 – 证明在每种装载方式下各点的均一性、程序的重现 性 – 证明最冷点处所获得的灭菌效果符合既定要求。
D121 值范围(min)
1.5-3.0 0.3-0.7 0.4-0.8 0.4-1.0
13
实现无菌要求的标准手段
热稳定性产品(过度杀灭) – 美国 产品灭菌工艺的F0值不低于12分钟; – 欧盟 121℃×15分钟 热敏感性产品 – 控制产品在灭菌前的带菌量 – 产品灭菌工艺的F0值不低于8分钟.

29
商购生物指示剂的确认
1. 进行形态学和纯度确认(至少鉴别至菌属) 2. 芽孢计数复核 -蒸汽灭菌工艺用BI，95-100℃下暴热预处理15 分 钟 -环氧乙烷和干热灭菌工艺用BI，80-85℃下暴热预 处理10 分钟 -预处理后迅速转移至冰水浴内 -合格标准：Log( 实测值)在0.3-1.48Log( 标示值) 之间 3. D值复核(视实验室能力而定)
– 温度探头10-20支；探头精确度±0.5 oC; – 须有探头与腔室原探头并列放置; – 检测报警和安全系统的可靠性; – 真空系统的可靠性(产生的效率、维持时间等); – 灭菌温度下，各点间最大温差（腔室内的）< = 2 oC；同一点的最大温 差±1.0 oC; – 重复试验至少3次以证明重现性
18
灭菌工艺验证
确认（IQ、OQ） – 灭菌设备的运行符合设计要求 验证（PQ） – 产品灭菌程序的有效性和重现性 评估 – 灭菌时产品可能发生的变化给灭菌效果带来 的影响

19
灭菌工艺验证-IQ/OQ

检查设备构造、控制/监测系统、运行系统、安全系统及所 有零部件均与采购要求相同； 控制/监测仪表的校验，包括程序控制器、温度、压力和时 间控制设备，以及计时器、记录测量仪等； 试车–空载热分布试验
湿热灭菌工艺的微生物学验证知识
中国医药设备工程协会 蒋春 2008.01.16 上海
1
概念与方式

基础概念 灭菌工艺 无菌

药品达到无菌要求的两种方式 无菌生产工艺 最终灭菌
2
两种生产方式的比较

无菌生产工艺的局限

通常的无菌保证水平（10-3至10-6） 影响因素较多 赋予产品更高的无菌保证水平 生产中可变因素少，出现偏差的概率低 几乎能杀灭产品中的所有微生物

32
F0与FT的相互关系

F0 = D121.1 ×( logN0 -logNt ) FT = DT ×( logN0 -logNt )
F0 / FT = D121.1 / DT = 10(T －121.1)/Z = L (灭菌率)
33
31
药典对F0 的要求
BP – 蒸汽灭菌程序赋予产品的F0值不得低于8分钟 – 制定依据: 多数嗜温性细菌芽孢在121.1 oC下的D值在30秒 至1分钟之间. USP <1211> – 蒸汽灭菌过度杀灭程序赋予产品的F0值不得低于12 分钟. – 目标: 使在121.1 oC下D值为1分钟的细菌芽孢下降12个对 数单位(双倍于无菌保证值). – 可采用其它灭菌程序，但要保证符合无菌标准 EP 、CP – 蒸汽灭菌程序通常应为在121 oC下灭菌15分钟 – 可采用其它灭菌程序，但要保证符合无菌标准
工艺开发
确定参数 ·升温阶段 ·保温阶段 ·降温阶段
装载类型
蒸汽不可透 过型物品 (液体型) 蒸汽可透过 型物品
工艺类型
饱和蒸汽型 ·预真空式 ·重力式 空气超压型 ·蒸汽/空气 混和方式 ·过热水方 式
性能确认
物理学方法 · 温度分布 · 热穿透 生物学方法
连续控制
日常放行 · 工艺评估 · 系统适用 性 再确认 变更控制

23
无菌的影响因素

Nt = N0 -NR
PNSU = N0 -DR
Nt –灭菌后微生物残存量； PNSU -非无菌品概率； N0 -灭菌前微生物含量； N0 -灭菌前产品的污染 水平； NR -灭菌时的杀灭量。 DR -灭菌时的杀灭水平。
24
热力灭菌的基本规律

在一定温度下微生物数量的对数 值与灭菌时间的线性关系

30
F0的定义及其意义





F0是指在某特定温度下所产生的灭菌效果与在121.1oC 下相等效时所需要的灭菌时间（分钟）. 121.1 oC 或250 oF表示~100 KPa 饱和蒸汽的温度, 为 标准灭菌温度； F 0值用于评价热（湿/干热）灭菌工艺的对微生物的杀灭 效果. F0值可用来比较不同温度下的灭菌效果 F0值既可用生物学方法测定，也可用数学方法积分测得 （积分时务必采用121.1 oC, 因为每相差0.1 oC, F0 将 会产生2.4% 的偏差）

17
灭菌程序的效力测定

生物学手段（FBiological）
– 用特定的生物指示剂作为标准微生物制剂 – 数据直接反映灭菌效果 – 有时可取代物理手段的不足(如探头无法放入安瓿瓶) – 局限性：较难进行统计学分析

物理/数学手段（FPhysical）
– 用灭菌值F0作为评价标准 – 精确测定热分布和热穿透状况 – 便于准确计算不同灭菌条件下的灭菌效果 – 测量数据便于统计学分析

16
灭菌程序的开发与设计
根据灭菌前带菌量进行设计 – 基于对灭菌前产品所含微生物的耐热特性和数量以及产品的 热稳定性 – 灭菌后产品的污染概率须小于10-6。 过度杀灭法 – 基于工艺程序能杀灭更加耐热微生物，并且再加上 一定的安全系数； – 理论上对生物指示剂孢子的杀灭能力达到10-12。 将两者相结合 – 兼顾产品的热稳定性和无菌要求。


湿度 微生物的热致死特性
12
适于湿热灭菌工艺验证的微生物
菌种名称
嗜热脂肪芽孢杆菌 Geobacillus stearothermophilus 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 凝结芽孢杆菌 Bacillus coagulans 梭状芽孢杆菌 Clostridum sporogenes
湿热灭菌—导致细胞内关键性蛋白质 和酶发生热变性或凝固.湿度对该破坏 性过程起促进作用. 干热灭菌---使微生物氧化而不是蛋白 质变性.