A注射液灭菌工艺验证方案公司名称目录1.概述2.验证目的3.验证依据4.支持文件5.验证小组成员及职责6. 生物指示剂验证试验方法7.验证合格标准7.1A注射液生产全过程部分微生物污染监控措施7.2灭菌釜技术要求7.3湿热灭菌工艺的生物学验证技术要求7.3.1沸腾试验阴性7.3.2沸腾试验阳性8．湿热灭菌验证操作步骤8.1 X．PSM．B型旋转水浴式灭菌釜确认8.1.1概述8.1.2运行确认8.1.3空载热分布8.1.4满载热分布8.1.5热穿透试验8.1.6升温速率试验8.2生物指示剂验证（挑战性试验）9.取样计划及样品编号10.验证结果、分析及评价10.1 A注射液工艺优化、偏差处理及整改措施汇总10.2 A注射液灭菌前药液微生物限度警戒线及行动线的确认11.验证培训12.验证合格证书13.附件附件1A注射液无菌保证与国际GMP差距附件2 生物指示剂制备方法附件3 A注射液灭菌工艺验证预试验取样计划（系列）附件4 A注射液灭菌前不同工艺环节的药液生物负荷及沸腾试验调查总结附件5 A注射液湿热灭菌工艺验证待确认修改的相关SOP目录附件6 A注射液湿热灭菌工艺验证待建立相关SOP目录14.附录：附录1 A注射液射液灭菌前药液生物负荷及无菌保证值汇总表附录2 灭菌釜运行测试记录附录3 空载热分布汇总记录附录4 满载热分布汇总记录附录5升温速率试验记录附录6 A注射液灭菌工艺微生物学验证记录附录7 A注射液灭菌工艺验证取样计划及项目编号附录8 A注射液灭菌工艺验证取样记录附录9 偏差处理记录附录10验证培训记录附录11验证合格证书1．概述：中国药典（05版）要求无菌制剂必须满足SAL≤10-6无菌保证水平[可用公式（F0- D污121℃×lgN）/D污121℃≥6表示，见 C-P216，3-14]。

A注射液采用湿热终端灭菌，其灭菌程序参数设定为 116℃，30min（经计算所得F0＝9.48，实测F0值在10-14之间，2009年灭菌釜验证数据），属于残存概率灭菌范围（8≤F0＜12）。

其最终产品的无菌质量取决于灭菌前产品中生物负荷、孢子耐热性及灭菌工艺的杀灭效果，所以产品应采用控制灭菌前药液的含菌量（生物负荷）的灭菌工艺。

灭菌制剂的无菌保证水平（SAL, sterility assurance level）是指灭菌后制剂中微生物的残存概率。

任何灭菌工艺均应当能使产品中的污染菌含量下降至一个菌后，再下降6个对数单位，才能保证产品经过灭菌后其中非无菌品概率不超过1/百万（即SAL ≤10－6）。

由于无菌检查的局限性，灭菌后含有残活微生物的样品往往难以被抽检到。

因此，灭菌制剂的无菌保证不能仅仅依赖于最终产品的无菌检查结果，而必须依靠生产过程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP管理。

对比国际GMP，A注射液无菌保证存在缺陷及整改措施、整改计划如《A注射液无菌保证与国际GMP差距》（附件1）所示。

本次验证克服A注射液以往的灭菌工艺验证，尚未能够提供产品满足SAL≤10-6无菌保证水平的证据的缺陷。

为确保每批产品无菌保证水平达到药典要求，解除潜在的产品质量安全风险、确保临床安全用药，特设计重新进行A注射液灭菌工艺验证。

通过灭菌工艺验证寻找影响微生物污染的关键质量控制点，采取合理、科学的纠偏措施，达到灭菌工艺能够稳定控制灭菌前药液的含菌量（生物负荷）的效果，将各种纠偏措施形成书面SOP并在正常生产时实施操作，使灭菌前药液生物负荷值处于控制水平线以下，为证实确保成品SAL ≤10－6提供验证证据。

作为本次湿热灭菌验证的预试验：（1）已设计与生产同步进行了A注射液灭菌前药液含菌量等检测方法学确认，详见《A注射液灭菌前药液含菌量等检测方法学确认报告》。

（2）已设计与生产同步进行了预试验《A注射液灭菌前不同工艺环节药液生物负荷及沸腾试验调查》（附件3），按照《A注射液灭菌工艺验证预试验取样计划》（系列，附件4）进行取样检测；调查结果详见《A注射液灭菌前不同阶段的药液生物负荷及沸腾试验调查总结》（附件5）。

（3）已设计与生产同步进行了《小容量注射液车间HVAC系统再验证》，重点：增加对洁净区关键区域如配制、灌装、百级层流罩下的动态监控（浮游菌、沉降菌、悬浮粒子），确认车间洁净区生产环境动态变化下对灭菌前药液生物负荷的影响规律。

已将欧盟GMP无菌制剂生产要求的洁净区“动态”验证技术要求写入该验证方案。

（4）已设计与生产同步进行了《洁净氮气系统再验证》，重点：确认灌装直接接触药液的洁净惰性气体的洁净度符合要求；监控灌装前后（最差状况）的洁净惰性气体微生物负荷。

因此，本次验证区分为三部分：第一部分：确认现有硬件条件下，A注射液灭菌前不同阶段的药液生物负荷及沸腾试验的规律，分析、确认关键质量控制点，在不影响产品其他质量指标的前提下，进行硬件或者工艺参数或者人员操作方法的缺陷分析、改造及纠偏，并确认和评价其纠偏措施的整改效果，以使产品灭菌前药液生物负荷实现稳定可控。

第二部分：对灭菌釜性能进行再确认（一年一次，由制造商进行）。

第三部分：对A注射液进行湿热灭菌工艺微生物学验证，包括：——选择适宜的生物指示剂进行挑战性试验。

——建立、确认产品无菌保证的相关企业内部控制标准（如灭菌前药液生物负荷警戒标准、纠偏标准，沸腾试验等），并通过验证形成日常监控的SOP。

——发现污染菌耐热性大于生物指示剂时，分离污染菌孢子，制备浓度适宜的生物指示剂，再次重复进行验证。

2.验证目的2.1确认灭菌釜性能是否仍然符合技术要求和工艺目标。

2.2选择适宜的生物指示剂，在灭菌釜各冷点进行最差状况的挑战性试验。

2.3对预试验监测结果进行关键质量控制点的分析，确认适宜的纠偏整改措施，优化工艺条件、加强过程控制。

2.4确认在现有灭菌工艺条件下，有关产品无菌保证的相关企业内部控制标准（如灭菌前药液生物负荷警戒标准、纠偏标准，沸腾试验等），形成SOP，进行日常监控。

2.5确认原辅料质量标准、洁净区环境、工艺用水等的微生物监控计划（检测频率及限度值）能否符合产品无菌保证和质量属性，确认设备清洁程序、维修保养程序、灭菌操作工序等是否需要修订。

3.验证依据及参考资料：：《现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术》，潘友文，2004年4.支持文件：X.PSM.B540型旋转式水浴灭菌器操作程序——文件受控号X.PSM.B540型旋转水浴灭菌釜维修保养程序——文件受控号A注射液半成品检验操作程序——文件受控号A注射液检验操作程序——文件受控号无菌检查法检验操作程序——文件受控号微生物限度检查法检验操作程序——文件受控号取样管理规程——文件受控号《灭菌釜性能再确认报告》（当年度）待验证修订/确认的GMP文件——见附件5，A注射液湿热灭菌工艺验证待修改相关程序目录（如《配制灌注系统清洗、消毒程序》，《洁净区环境监控管理规程》，《灭菌釜冷却水质量标准》等）《A注射液灭菌前药液含菌量检查方法等确认报告》为本次验证制定的程序文件目录：5.验证小组成员及职责：6. 生物指示剂验证试验方法6.1生物指示剂的选择：由于A注射液灭菌程序为116℃×30min，属于残存概率灭菌范围（8≤F0＜12），在湿热灭菌工艺验证预实验沸腾试验阴性的前提下，拟使用市售标准生物指示剂。

生物指示剂应具备孢子稳定、耐热性强于被灭菌物品中常见的污染菌、系非致病菌、易于培养等特征。

本次验证用标准生物指示剂（BI）参数：菌种：嗜热脂肪杆菌ATCC7953。

DB：1.7，标准生物指示剂在121℃时下降一个对数单位所需要的时间，分钟。

浓度：103cfu/支。

批号：1001111。

有效期：一年。

供应商：上海鸿雍生物科技有限公司。

F 0值：F≥8。

存活时间：121℃饱和蒸气下存活时间不少于3.9分钟。

死亡时间：121℃饱和蒸气下死亡时间不少于19分钟。

标定结果：在药液D值为0.9。

6.2生物指示剂的使用方法：应将挑战菌接种到药液，接种BI后的安瓿灭封后（F0值8≤X<12）放置冷点处（不少于20个），经最低灭菌程序后，应无菌检测全部呈阴性，详见A注射液灭菌工艺微生物学验证记录。

7.验证合格标准7.1A注射液生产全过程部分微生物污染监控措施：A注射液湿热灭菌生产全过程部分微生物污染监控措施如表1所示：表1：7.2灭菌釜技术要求：如表2所示，详见《灭菌釜性能再确认报告》（当年度）。

表2：7.3湿热灭菌工艺的生物学验证技术要求：7.3.1连续进行五批次产品在设定条件下灭菌后，应： 灭菌前药液生物负荷值： 警戒限（CFU/20ml ）≤50纠偏限（CFU/20ml ）≤100（即lgN 0≤2） 沸腾试验：阴性或阳性。

阳性时应检测污染菌D A 值，污染菌D A 值应小于标准生物指示剂D BI 值。

接种挑战菌的药液（BI ）检测（验证期间）：20支/釜，应全部阴性。

无菌保证值：SAL ≤10-6（或者SAL ≥6）。

7.3.2 SAL 判断或计算方法如表所示：其中：SAL ：无菌保证值。

-lg ：微生物存活概率。

lgN 0：药液灭菌前污染菌污染水平。

D A ：灭菌前药液的污染菌芽孢在121℃时下降一个lg 值所需要的时间，分钟;沸腾试验阴性时取0.5计算，沸腾试验阳性时按照所测得的污染菌D A 值计算。

F 0：产品设定的F 0值（也可以使用实际测得的F 0）。

[计算]假设：N0=1000个孢子数，沸腾实验检测阴性，DA=0.5，F=9.48，求SAL？∵SAL= (F0/DA-lgN)=（9.48/0.5-3）=15.96＞6，∴产品准予放行。

沸腾试验阳性时，DA取实际检测值代入上式计算即可。

7.3.3取样细则：（1）取灌装前、中、终端各3支样品，分别编号为批号+A1（3支相同，前端）或批号+A2（3支相同，中端）或批号+A3（3支相同，终端）；取样人员应在安瓿上写明标记。

（2）灌装前端取样灌装第1、2、3支密封后药液；灌装中端请取样人员与工段长或灌封人员共同判断并连续灌封取样；灌装终端取连续灌封的最后3支药。

（3）取样送样应在前、中、终端各3支标记样品各自临近灭菌前取出，迅速送QC生测人员，按照《A注射液灭菌前药液含菌量检查及污染菌的耐热性检查操作程序》（ZKSN-23-9）进行检验，检测结果应记入A注射液射液灭菌前药液生物负荷及无菌保证值汇总表（附录1）。

（4）取样人员应逐项填写取样记录，并取样完毕递交车间工艺员。

7.3.4警戒与纠偏：当灭菌前药液生物负荷值超过警戒线时，应对主要污染菌作鉴别；含菌量一旦超过纠偏限度，立即通知车间，调查偏差原因，并采取相应纠偏措施，并再次进行连续五次的合格验证。

当沸腾试验阳性时，需要对阳性菌做鉴别；如果阳性菌系非芽孢杆菌，则可判为试验过程中的污染即假阳性；如阳性菌为芽孢杆菌，则应对污染菌做定量沸腾试验测定该污染菌的相对耐热性（DA）。