一：苏玉永,徐楚鸿,吕永宁.多酶微片胶囊中胃蛋白酶的活力测定[J].2004.24(4):214-1252.1.1对照品溶液的制备精密称取经105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量,加盐酸溶液(取1 moL·L-1盐酸溶液65 mL,加水至1000 mL,摇匀,即得)制成每1 mL中含0.5 mg的溶液,摇匀,备用。

2.1.2供试品溶液的制备取本品5粒,将内容物中的5片粉红色的胃蛋白酶糖衣片置研钵中,研细。

加上述盐酸溶液少许,研磨均匀,移至100 mL量瓶中。

加上述盐酸溶液至刻度,摇匀。

精密量取适量,用上述盐酸溶液制成每1 mL中约含0.2～0.4单位的溶液。

2.1.3测定法取试管6支,其中3支各精密加入对照品溶液1 mL,另3支各精密加入供试品溶液 1 mL,置(37±0.5)℃水浴中,保温 5 min。

精密加入预热至(37±0.5)℃的血红蛋白试液5 mL,摇匀,并准确计时,在(37±0.5)℃水浴中反应10 min。

立即精密加入5%三氯醋酸溶液5 mL,摇匀,滤过。

取续滤液备用。

另取试管2支,各精密加入血红蛋白试液5 mL。

置(37±0.5)℃水浴中保温10 min,再精密加入5%三氯醋酸溶液5 mL。

其中1支加供试品溶液1 mL,另1支加盐酸溶液1 mL,摇匀,滤过。

取续滤液,分别作为供试品和对照品的空白对照,照分光光度法,在275 nm波长处测定吸收度,见图1,图2。

算出平均值A s和A,按下式计算:式中,As为对照品的平均吸收度;A为供试品的平均吸收度;Ws为对照品溶液每1 mL中含酪氨酸对照品的量μg;n为供试品稀释倍数。

在上述条件下,每分钟能催化水解血红蛋白生成1μmoL酪氨酸的酶量,为一个蛋白酶活力单位。

2.2干扰试验按照处方配制无胃蛋白酶的空白样品,取适量,按2.1项下方法操作,结果在275 nm波长处几乎无吸收,说明处方中其他组分对胃蛋白酶活力的测定无干扰。

2.3线性试验精密称取经105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品85 mg,加上述盐酸溶液溶解并稀释至100 mL。

再精密量取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL各3份分别置试管中,依次加上述盐酸溶液至1.0 mL,按2.1项下方法操作,测得吸收度A值分别为:0.1383,0.2536,0.3757,0.4905,0.6111,线性回归方程为:Y=0.5912X+0.01909(r=0.9999),线性范围为:0.17～0.85 g·L-1,说明本方法具有良好的线性关系。

2.4回收试验按处方制备高、中、低各3份共9份模拟样品,按2.1项下方法分别测定回收率,平均回收率为101.6%,结果见表12.5稳定性试验取供试液1份,室温放置,按2.1项下方法分别于0,1,3,5,8 h测定,结果测得吸收度分别为0.3926,0.3701,0.3749,0.3745,0.3704,平均吸收度为0.3765,RSD为2.46%,表明供试液在8 h内稳定性良好。

2.6重复性试验取本品45粒,将内容物中的粉红色胃蛋白酶糖衣片共45片,精密称定,置研钵中,研磨均匀。

精密称取适量,制备7份供试液,分别按2.1项下方法测定胃蛋白酶活力,测定结果见表2。

结果表明本方法的重复性良好。

表2重复性试验结果二：张耀庭,李娟,吉海滨等.应用分光光度法测定胃蛋白酶活力[J].1998,11(4):196.2.1 对照品(酪氨酸)、样品(胃蛋白酶)、底物(牛血红蛋白)溶液均按CP90方法配制。

对照液浓度为500陀/以，样品稀释倍数为40000，底物浓度为1%。

分别取对照液，样品溶液各1耐，置37士0.5℃水浴中，保温5而n，精密加人预热至37士0.5℃的血红蛋白试液srril，摇匀，立即计时，在37士0.5‘C水浴中反应10nlin，立即精密加人5%三氯醋酸5司，摇匀，滤清，在275nm处测定吸收度(同时分别做空白对照)。

活力按CP90方法的公式计算即得。

2.2 对6批样品进行测定，该法重现性好，测定值的变异系数均在5.0%以下。

取一批胃蛋白酶，在上述分光法测定条件下，在终止酶促反应后，间隔不同时间观察吸收度的变化值，测得结果表明，4h内测定活力基本稳定，略有上升，但对结果影响不大。

对n批胃蛋白酶分别用不发光法和蛋清法同时进行测定，以分光法活力X对蛋清法活力Y进行线性回归，得回归方程为:Y=2080+2.77X，r=0.9904，P<0.01。

三：井春梅，史丽敏，王晓华.凝乳法测胃蛋白酶合剂活力的评价[J]. 1993，10（2）：28-29.蛋白酶的活力测定精密称取胃蛋白酶约2g，置100ml容量瓶内，加稀HCI至刻度，再将其稀释100倍作为样品液，按中国药典1990版胃蛋白酶活力测定法测得结果:每1g胃蛋白酶的蛋白消化力为1730活力单位。

2.3胃受白醉合荆的活力侧定将自配的胃蛋白酶合剂用稀盐酸(pH1.50)稀释100倍作为样品液，按1990版中国药典中的方法测定酶活力，同时再按《中国医院制剂规范》中的凝乳法测其凝乳时间，成人胃酶的测定结果见表1，表2，小儿胃酶见表3，表4。

以上实验是在室温29士1℃下进行的，为了进一步了解温度对其效期的影响，我们又单用牛血红蛋白分光光度法在室温21士1℃下做了一组实验，结果见表5。

通过牛血红蛋白法和凝乳法对胃酶合剂活力测定的比较，我们发现两者测定结果不一致。

随着放置时间的延长，牛血红蛋白法的酶活力单位数下降很快，而相应的凝乳法随时间下降的幅度小。

而且当牛血红蛋白法的胃酶活力单位数降至低限以下(<1200u)时，凝乳法的时间仍然符合规定(<305)。

相比之下，我们认为凝乳法不能很好地反应出胃酶活力的变化。

牛血红蛋白分光光度法在严格控制酶促反应的条件下，即pH在1.50，温度37士。

5℃，反应时间为10min，测定结果重现性好，而且该方法快速，灵敏，供试液稳定，能真实地反应出酶活力的变化情况。

四: 刘瑜明.简介胃蛋白酶活力测定各种方法[J].:47-50.1.凝固卵蛋白测定法其原理是用磨碎的卵蛋白为底物用消化凝固卵蛋白的倍数来测胃蛋白酶的活力，依据胃蛋白酶最适的温度为休温倩况下，最高不超过52℃。

最适的酸碱度PH1.2一1.5之间(以1.4最佳)。

并加少量的氯化钠为激活剂，在恒温水浴中进行消化后，测定未被消化蛋白的限度，在限度以下(未消化的蛋白)为合格。

此乃限度检测法，此法优点是与生理活性相符合，操作与计算简单易行，专属性高，并可同时测定很多批号的胃酶。

缺点是此方法是古老经典的检测方法，只停留在限度实验水平上。

由于鸡蛋来源不一，新鲜度不同，甚至同一只鸡在一周之内所产生的蛋也不同，对测定结果也有影响，以一周内产生的蛋，以蛋白干固物方法测定，最高为15.81%，最低为10.02%，说明了即便是同一只鸡，鸡蛋的蛋白也是有差异的。

用此方法来控制胃蛋白酶效价，使产品在负责期内不变，重现性合格，只有增加保险系数的方法，如把1:3000倍的胃蛋白酶，控制在1:3500倍以上，才能保证效价。

2.以胃酶标准品作对照的凝固卵蛋白法此种方法虽然克服了鸡蛋卵蛋白的影响，但是由于胃酶纯度的影响，标准品也是胃酶，胃酶是属蛋白质范畴，若用胃酶作对照其变性问题应考虑，曾对胃酶效价动力学变化进行过探讨，刚生产出来的胃酶(原酶)，效价不稳定，必须有个稳定过程，一般前六个月放置后其效价日趋下降，待六个月后才稳定平衡。

因之胃酶标准品(对照品)的生产，应考虑到胃酶的工艺，纯度，稳定性之间的关系，加以探讨后才能使用，否则标准品不稳定。

3.干蛋白法为克服新鲜鸡蛋的卵蛋白之间的差异，曾设想改为干蛋白为底物的测定法，通过实验，证明此法重现性更差.由于卵蛋白中含有少量的葡萄搪，制成的干蛋白片后，逐渐发生褐变，据报导，过去蛋白行业制造干蛋白片是沿用自然发酵的方法除去其中的葡萄雄，但产品发臭，后又改用葡萄糖氧化酶方法，使蛋清肠翻，由于干蛋白片加工处理工艺的不同，加之翻份的新鲜度不同，对胃酶效价测定的影响，尚需进一步探讨。

4.血红蛋白为底物的福林试剂比色法德国药典(1978年)已收载，我国药典(1985年)经过改进已列入含糖胃蛋白酶的测定。

其原理是利用福林试剂中的钥酸钠，钨酸钠，在实验条件下可与被胃蛋白酶水解血红蛋白产生的可溶于三氯醋酸的水解产物为酪氨酸及色氨酸作用使福林试剂还原成磷钥兰和磷钨兰，溶液由黄色变为兰紫色，其颜色的深浅与胃蛋白酶活性成线性关系。

然后用酪氨酸为标准进行对照，计算胃蛋白酶的活力单位并作空白试验。

此法优点是操作时间比卵蛋白法迅速。

由于牛血红蛋白为干蛋白粉，较鸡蛋容易保存，价廉易得，比停留于限度测定有进步。

缺点是我国有的单位实验室没有恒温设备，室温夏冬季悬殊，带来误差较大，又由于血红蛋白一般含有12.77%精氨酸的低分子蛋白质，所含的各种成分及纯度有差异，影响胃蛋白酶活力测定结果的准确性。

所以血红蛋白应该考虑生产厂家与批号之间的差异，现介绍德国产牛红血蛋白与国产牛血红蛋白同时测定几批1:3000倍胃蛋白酶的结果。

见表1。

活力单位表示法(u/g):用血红蛋白为底物在实验条件下，37℃每分钟催化血红蛋白，其水解产物在58Onm波长处产生与1个微克分子(1协mol)酪氨酸相同的吸收度为1个胃蛋白酶活力单位(u/g)。

从以上结果看，血红蛋白来源不同，对测得数据是有影响的。

另外也应考虑血红蛋白的变性对测定胃蛋白酶的活力影响，由于血红蛋白也是属于蛋白质之一，所以也存在蛋白质的变性问题，变性后的蛋白质溶解度降低，对测定胃蛋白酶活力亦有影响。

用此方法测定胃蛋白酶的效价，要求范围较宽，德国药典允许有25%的差异范围，说明此法不应和化学测定法一样要求那么高。

目前国内胃蛋白酶的生产质量不断提高，有的厂用卵蛋白表示法巳达到1:20000倍，若用血红蛋白为底物福林试剂法测定必须予算出应加入的酶浓度的量。

据周有源氏在药物分析杂志，“胃蛋白酶活力测定法测试条件探讨”一文中已有数据可查，胃蛋白酶加入量在0.2一o.6mg时，酶促反应速度(初速度)与其浓度成线性关系，加入量超过。

·6mg后，其速度增加较慢，随后表现出不规则，而且误差大，在1.2一2.omg 部分尤为突出，故在实验中不能任意改变酶浓度。

我们在实验中也发现此点，据此，为了使此方法也适用于原酶(高倍数)的测定曾作出系列实验，我们实验结果1:3000倍卵蛋白相当于血红蛋白560一750u/g(德国牛血红蛋白为底物)，其中间值为655u/g)所以lu/g胃蛋白酶之4.58克卵蛋白。

可用稀释倍数来控制胃酶的量，如取原酶0.1g，加酸溶液稀释至200毫升，再取出10毫升稀释至100毫升。

这些步骤可相同，所不同的是操作取用量，例如1:1400川合则应取酶溶液体积为1x30八选=2.14ml，酸液体积补足总量4ml即可。