15 世纪被发现（重晶石在强烈阳光下的发光）
1944 年： Lewis 提出磷光用于分析的可能性；
1957 年： Keirs 将磷光分析用于定量分析及多组
份混合物分析；
1963 年：广泛用于血液及尿液中痕量药物及农药 残留量分析。
67
internal conversion
S2
vibrational internal conversion relaxation intersystem crossing
瑞利峰 拉曼峰
31
第三节荧光分析仪器
instrument of fluorescence analysis 一、仪器的主要部件 二、仪器类型
32
I0
It
F
33
一、仪器的主要部件 激发光源(light source)
样品池(吸收池)(absorption cell) 单色器(monochromator ) 检测器(detecor) 记录及数据处理器(display)
发射 单色器
检测器 数据处理 仪器控制
45
二、仪器类型
1. 荧光光度计(fluorometer)
2. 荧光分光光度计(spectrofluorometer)
46
荧光光度计 光源 溴钨灯、汞灯
荧光分光光度计 氙灯
单色器
光谱 应用
滤光片、棱镜
荧光光谱 定量分析
光栅
激发光谱、荧光光谱 定量、定性分析
47
58
（五）生命科学中
59
1. 探测和分析蛋白质的分子结构
60
2. 基因检测-分子信标
61
3. 细胞生物学中的应用
62
4.膜融合机理的研究
63
三、荧光光度计的发展
1928年第一台光电荧光计问世以来.经过三 阶段: 1.手动式. 2.自动扫描 3.微机化
64
1. 分辨率提高：5.2μs～1ps,分辨率达±0.5ps. 2.扫描速度加快： 30000nm/min 3.多功能：可同机进行荧光、磷光和化学发光测
对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，
F k' c
28
五、影响荧光强度的外部因素 relation between fluorescence and molecular structure
1.溶剂的影响
2.温度的影响 3. 溶液pH的影响 4.溶液荧光的猝灭
NH3 NH2 NH
OH H
OH H
27
由于溶液的荧光强度与溶液对光的吸收程 度及荧光效率成正比，即：
F kΦ I 0 (1 10
kΦ I 0 (1 e
F ΦI a I a I 0 I I 0 (1 10
abc
abc
)
)
)
2.3 abc
当abc≤0.05（即溶液很稀）时，
F 2.3kΦ I 0 abc
发光的波长不同) (2)分子荧光和原子荧光(发射荧光的粒子不同)
7
特点 (1)灵敏度高, 通常比分光光度法高 2～4个 数量级 (2)选择性好 (3)样品用量少和操作简便
8
第二节基本原理
一、分子荧光产生过程
二、激发光谱与荧光光谱
三、荧光物质的分子结构
四、荧光强度与溶液浓度的关系
五、影响荧光强度的外部因素
蒽
0.46
400
一般而言，π电子共轭体系越大，荧光效率越高，且 荧光光谱红移。
H
H C C H
C
C
H
强荧光
无荧光
23
（3）刚性平面结构
刚性平面结构可减少分子的振动，使分子与溶剂和其它 溶质分子的相互作用减小，因而有利于提高荧光效率。
24
25
(4) 取代基效应 化合物 荧光相对强度
苯
苯酚
OH
10
12
internal conversion
S2
vibrational internal conversion relaxation intersystem crossing
S1
energy fluorescence absorption external conversion
T2 T1
phsophorescence
54
（二）药物（中药）
1. 测定生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚
2. 香内酯荧光分光法定量分析，其发射光谱
λem=(385±1)nm，λex=301nm或激发光谱
λex：(328±1)nm，λem：425nm
55
（三）无机元素
1. 测定杨梅黄素中痕量锗的新方法。锗与杨梅黄素
在磷酸介质中形成配合物，此配合物在乙醇溶液
缺点：应用范围小。
50
一、定性分析
荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光谱，
因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。
定性方法：将特征光谱的形状、波长范围与标
准品对照，看是否一致。
51
二、定量分析 F－F0
1.标准曲线法：
Fx －F0
cx
c
52
2. 直接比较法
如果荧光物质的标准曲线过零点，且线性良好， 可用直接比较法测定。在线性范围内，测定标样和
18
NH2
苯胺
苯甲酸 硝基苯
20
3 0
COOH
NO2Leabharlann 给电子基团：如–OH, –OR, –NH2, –CN， –NR2等， 增强荧光。 吸电子基团：如–COOH, 减弱甚至熄灭荧光。
C O , –NO2, –NO等，
26
四、 荧光强度与溶液浓度的关系 根据Lambert-Beer定律：
所以，
pH<2 无荧光
7~12 蓝色荧光
>13 无荧光
29
造成荧光熄灭的原因： （1）碰撞熄灭 （2）静态熄灭 （3）转入三重态的熄灭：
（4）荧光物质的自熄灭：
（5）内滤光作用和自吸现象
30
5.散射光（scattering light）
（1）瑞利（Reyleigh）散射光
（2）拉曼（Raman）散射光
怎样检测样品中的核黄 素（维生素B2） ？
核黄素（维生素B2） 黄色至橙黄色结晶性粉末
饱和水溶液呈中性， 呈淡黄绿色，有荧光。
1
molecular fluorescence analysis
郭建丽
卫生化学教研室
2
第一节概述
荧光的发现
植物愈创木切片黄色 水溶液 ——天兰色荧光；
3
荧光的发现
4
5
49
第三节荧光分析方法与应用 fluorescence analysis and application
特点：
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；
检测下限：0.1～0.1g/cm-3
相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少
第一滤光片 光源 狭缝 样品池 第 二 滤 光 片
样品
光源 程序
狭 缝
激发 单色器
表面 吸收 物质
发射 单色器
指示器
信号输出
检测器
荧光计示意图 记录器 荧光分光光度计示意图 放大器
检测器
48
可获得三维光谱图的仪器
如：日立4500型荧光分光光度计。
可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图
量
4.促使应用技术的发展
例如：时间分辨(相分辨)；同步荧光；三维荧光；荧 光光纤化学传感器
65
MFS与UV/Vis 法比较：
原理
灵敏度, 选择性
测定方法
I0 F It
UV/Vis 吸收
MFS 发射
10-5～10-6mol· -1 L
10-7～10-9 mol· -1 L
I0 F
66
第五节 磷光分析法简介 molecular phosphorescence analysis 磷光的发现
9
一、荧光的产生过程 1. 分子能级与跃迁
S1
S0
10
2. 单重态与三重态
处于分立的电子轨道的非成对电子，平行自旋比配对自旋更稳 定，因此，三重激发态的能级比相应的单重激发态的能级低。 11
3.激发态→基态的能量传递途径
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛豫
vibrational relaxation
S0
l1
l2
l 2
l3
13
二、激发光谱和荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
S1
energy
T2 T1
phsophorescence
absorption
试样的荧光强度，进行比较：
Fs F0 Kc s Fx F0 Kc x Fs F0 Fs F0 cs cx cs Fx F0 Fx F0 c x
53
三、荧光分析法的应用
（一）药物（西药类）
1. 采用荧光分光光度法测定奥沙普嗪肠溶胶 囊的含量，测定波长为λex=287.0nm， λem=368.0nm。 2. 替硝唑 λex=360nm ,λem=420nm 3. 氟康矬 λex=261nm , λem=284nm