(2-巯基乙醇存在，pH9~10的缓冲溶液)
2.无机化合物的荧光分析 测定方法：与具有π电子共轭结构的有机化合物形成 荧光配合物
研究对象 ▪阳离子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、 Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、 Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr ▪阴离子：CN-、F-与Al、Zr离子强烈配合→原有荧光 配合物的荧光减弱甚至熄灭
IF 2.3I0abc
IF Kc 稀溶液
五、影响荧光强度的因素
1. 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去激活的
几率减少，增加荧光效率，从而增加荧光强度。
2. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成
都将使化合物的荧光发生变化。
3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
第二节 荧光分析仪器

激发滤光片
发射滤光片
930型荧光计光路示意图
一. 主要组成及部件的功能
荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图
光源
激发单色器
氙 灯
光电倍增管
样品池
问题：荧光分光光度 计与紫外-可见分光光 度计有何异同点？
数据处理 仪器控制
发射单色器
光源
激发 单色器
样品池
发射 单色器
检测器
数据处理 仪器控制
3．下列对荧光的叙述正确的是：（ C ）
A．从第一电子激发态的不同能级发出光量子回到基态 B．从激发三线态的不同能级发出光量子回到基态 C．从第一电子激发态的最低振动能级发出光量子回到基态 D．从激发三线态的最低振动能级发出光量子回到基态
判断题
1. 体系间跨跃是因为激发态分子和溶剂分子发生碰撞而交换能量 所致。( )
（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
（3）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强 吸电子基，使荧光减弱甚至熄灭
2.化合物的结构与荧光
（4）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。
四、荧光强度与荧光物质浓度的关系
磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
l
‘ 2
>
l
2
>
l
1
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定荧光波长(选最大激发光波长),化合物发 射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 （图 中曲线I ） 。
选最强荧光强度的激发光波长λex为测定波长， 以提高灵敏度。
[课后练习]
▪名词解释：荧光与磷光、振动弛豫 ▪溶液荧光光谱有哪些特征？ ▪能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？ ▪为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？
填空题
1．荧光是 物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的 返回基态时发射出的光
2．荧光和磷光的区别在于荧光是从单线激发态开始的，磷
光是由
。
3．荧光发射光谱也称荧光光谱，其发射波长总是
激发波长。
4．能够发射荧光的物质应具备的条件是
、
。
5．影响荧光强度的外部因素有
。
选择题
1．荧光物质的激发光谱与紫外吸收光谱的形状：（ B ） A．完全一样 B．基本相似 C．肯定不一样 D．难以说清
2．对荧光测定最有干扰的是：（ B ） A．波长比入射光长的瑞利光 B．波长比入射光长的拉曼光 C．波长比入射光短的瑞利光 D．波长比入射光短的拉曼光
荧光分析仪器的主要部件
➢激发光源：汞灯、卤钨灯、氙灯、 ➢分光系统：滤光片（两个）、单色器（光栅） ➢样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光 ➢检测器：紫外-可见（光电倍增管） ➢显示系统：指针式、数字式及计算机显示
二、荧光分析仪器的类型 ➢1.荧光光度计 ➢2.荧光分光光度计
➢荧光分光光度计 激发单色器
样品池
发射 单色器 检测器
数据处理 仪器控制
紫外-可见分光光度计 测量池(吸收池)
It
I0
荧光分光光度计 样品池
It IF,p
I0
第三节 定性和定量分析
一、定性分析
定性依据荧光光谱和激发光谱
二、定量分析
定量依据：F=Kc
1. 标准曲线法
直接荧光标准曲线法
F Fx
Cx
Cs
2.直接比较法 Fs F0 Cs Fx F0 Cx
荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。 如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、 羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分 子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。
(浓度限量1g~1mg/ml)
荧光熄灭法：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄 灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选最大激 发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与激发光波长关系曲 线(图中曲线II或III)。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
2. 三维荧光光谱
I F ∝f (λex 、λem)
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、荧光的产生与分子结构的关系
2. 荧光光谱的形状不仅与物质的性质有关，而且还与激发波长 有关。 （ ）
3. 一般而言，分子的共轭越多，刚性平面性越好，荧光效率越高。
() 4.在用荧光分光光度计测定时，仪器刻度一定要用对照品
溶液进行校正。
()
➢pH值 弱酸、弱碱
NH
+ 3
OH H+
OH -
NH 2
H+
NH -
pH<2
pH7~12 蓝色荧光
pH>13
4. 散射光： 一部分光由于光子与物质分子的相互碰撞，使光子的运
动方向发生改变而向不同方向散射。 瑞利散射光：选择适当的荧光测定波长或选用滤光片可消除
拉曼散射光：选择适当激发波长的方法消除
Cx

Fx Fs
F0 F0
Cs
第四节 荧光分析新技术
一、荧光新技术
➢激光荧光分析 ➢时间分辨荧光分析 ➢三维荧光分析 ➢核酸分子荧光探针 ➢薄层扫描法中的荧光扫描法
荧光分析的应用 1.有机化合物的荧光分析 研究对象：芳香族及具有芳香结构的化合物
▪有机化合物：多环胺类、萘酚类、具有芳环或芳杂环 结构的氨基酸类及蛋白质 ▪药物：生物碱类；甾体类；抗生素类(青霉素、四环； 维生素类(维生素A、B1、B2、B6、B12等) ▪中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）
S0
l3
l1
l 2 l 2
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高 振动能级至低相邻振动能级间的跃 迁。发生振动弛 豫的时间10 -12 s。
内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能 级交换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃 回第一激发单重态的最低振动能级。
荧光光谱
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
拉曼光谱
瑞利光320nm
瑞利光350nm
拉曼光360nm
拉曼光400nm
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
5. 荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分 子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强 度与浓度不呈线性关系的现象。
固定发射波长、扫描激发波长
蒽的激发光谱
I F ∝f (λex 、λem)
固定激发波长、扫描发射波长
蒽的发射光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3. 荧光光谱的特征 a. Stokes位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长 b. 发射光谱的形状与激发波长无关 c. 与激发光谱呈镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱 形状一样）成镜像对称关系。
非辐射能量传递过程 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生
相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行
辐射能量传递过程
荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有强的紫外-可见吸收的特征结构(共轭大π键) （2）具有一定的荧光量子产率（）


发射的光量子数 吸收的光量子数

IF Ia
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常 数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生；
两种光源(紫外+可见)
空白溶液 (T=100%)
紫外无吸收 两面透光
荧光分光光度计
入射光与荧光垂 直方向
一种光源(紫外) 空白溶液(F=0) 荧光对照品溶液 (F=100%或50%)
低荧光材料 四面透光
紫外-可见分光光度计:
光源 单色器 样品池