生化制品技术实验指导《生化制品技术》实验大纲一、实验目的本实验是《生化制品技术》课程的配套实验，目的是增加学生对生物药物及生物技术制药的感性认识及提高学生的实验操作能力。

要求学生熟悉并掌握生物药物的制备过程和生物技术制药的基本操作方法。

二、适用专业及层次适用于生物制药技术专业学生三、实验内容和学时分配实验一牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备一、实验目的1.掌握盐析法的原理和操作。

2.掌握等电点沉淀法的原理和基本操作。

二、实验原理乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中，合成乳糖所需要的重要蛋白质。

牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白（caseins），酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。

利用此一性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。

酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。

将去除掉酪蛋白的滤液的pH 调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质即可随澄清液出去。

在经过一次pH沉淀后，即可得粗乳蛋白素。

三、实验器材烧杯（250ml和100ml）、玻璃试管（10mm×100mm）、离心管（50ml）、磁力搅拌器、pH计、离心机、水浴锅。

四、试剂和材料脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L （pH4.6）、乙醇。

五、操作步骤1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白（1）将50ml牛乳倒入250ml烧杯中，于40℃水浴中加热并搅拌。

（2）向上述烧杯中缓缓加入（约10min内分次加入）10g无水硫酸钠，再继续搅拌10min（或加热到40℃，再在搅拌下慢慢地加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液，直到pH达到4.8左右，将悬浮液冷却至室温，放置5min）。

（3）将溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。

沉淀悬浮于30ml乙醇中，倾于布氏漏斗中，过滤出去乙醇溶液，抽干。

将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到的是酪蛋白。

准确称重。

2.等电点沉淀法制备乳蛋白素（1）将制备酪蛋白操作步骤（3）所得滤液置于100ml烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3±0.1。

（2）将溶液倒入离心管中，6000r/min离心15min，倒掉上层液。

（3）在离心管内加入10ml去离子水，振荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5～9.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解。

（4）将上述溶液以6000r/min离心10min，上层液倒入50ml烧杯中。

（5）将烧杯置于磁搅拌加热板上，一边搅拌，一边利用pH计以0.1mlo/L盐酸调整pH至3±0.1。

（6）将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。

取出沉淀干燥，并称重。

六、结果与讨论1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量，并与理论产量（3.5g）相比较。

求出实际获得率（%）。

2.计算出100ml牛乳所制备出的乳蛋白素数量。

实验二卵磷脂的制备及鉴定一、实验目的学习从蛋黄中制备卵磷脂的方法和基本操作。

二、实验原理利用卵磷脂可溶于乙醇的性质，将卵黄溶于乙醇，卵磷脂从卵黄中转移到乙醇溶液中，可分离提取出来，而蛋白质等某些杂质从沉淀物中除去。

但由于乙醇溶剂抽提时，其他物质也一起被抽提，如甘油三脂、甾醇等。

利用卵磷脂不溶于丙酮的性质，用丙酮从粗卵磷脂溶液中沉淀磷脂，能使卵磷脂与其他脂质和胆固醇分离开来。

无机盐和卵磷脂可生产络合物沉淀，因此可利用金属盐沉淀剂将卵磷脂从溶液中分离出来，由此除去蛋白质、脂肪等杂质，再用适当溶剂萃取出无机盐和其他磷脂杂质，这样可大大提高卵磷脂纯度。

三、实验器材离心机、旋转蒸发仪、布式漏斗、抽滤瓶、真空干燥箱、层析缸、紫外分光光度计。

四、试剂和材料95%乙醇、丙酮、10%ZnCl2、2%氯仿、碘、甲醇、0.1%乙醇、无水乙醇。

五、操作步骤1、粗提室温下，取适量的鸡蛋卵黄用2倍于卵黄体积的95%乙醇进行提取，混合搅拌，离心分离（3000r/min，5min），将沉淀物重复提取3次，回收上清夜；然后减压蒸馏（45℃）至近干，用少量石油醚洗下粘壁的黄色油状物质；加入丙酮，抽滤，分离出沉淀物，真空干燥（40℃，30min），得到淡黄色的粗卵磷脂，称重。

2、精制取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醇溶解，得到约10%的乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10%的ZnCl2水溶液，室温搅拌0.5h；分离沉淀物，加入适量冰丙酮（4℃）洗涤，搅拌1h，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色蜡状的精卵磷脂；干燥；称重。

3、鉴定（1）薄层色谱分析将卵磷脂样品与对照品分别配成2%氯仿溶液，用GF254硅胶板进行层析，展开剂为氯仿∶甲醇∶水（65∶25∶4），层析完毕后，取出薄板，干燥，碘蒸汽显色。

（2）紫外吸收光谱测定将一定量卵磷脂样品溶于无水乙醇，配成0.1%乙醇溶液，用紫外分光光度计扫描其在90～400nm的吸收光谱，可测得卵磷脂的紫外最大吸收峰。

卵磷脂紫外最大吸收峰在215nm波长。

六、结果与讨论1.计算卵磷脂得率，讨论影响卵磷脂得率的主要因素。

2.根据薄层色谱图谱、紫外吸收光谱分析所制备的卵磷脂的纯度。

实验三薄层板的制备及使用实验一薄层色谱板的制备和使用目的要求：通过实验进一步理解薄层色谱技术理论，熟悉掌握薄层色谱板的制备和使用方法。

一、薄层层析的基本原理把吸附剂（固定相）均匀地铺在一块玻璃板上，将待分离的样品溶液点加在一薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的溶剂（流动相）展开，由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同及溶剂对不同物质溶解分配系数不同，当溶剂流过时，各物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附，解吸附，再吸附，再解吸附。

不易被吸附或易被溶剂溶解的物质相对移动得快一些。

经过一段时间的展开，不同的物质被彼此分开，最后形成相互分离的斑点。

将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后，应用特定的试药或方法将斑点显色，从而达到定性和定量的目的。

二、薄层板的制备1．玻璃板用一块玻璃板涂上很薄的吸附剂，如硅胶或氧化铝等，玻璃板要求薄厚一致，大小相同，表面光滑平整，一般玻璃只要合乎这些要求就可。

如果找不到平整均一的，将旧光学照像底片截成同样大小也可以。

用前先将玻璃用肥皂和水洗干净，必要时浸泡在清洗液中，然后水洗烤干，用纱布擦光。

玻璃板大小有各种规格，一般有20×20、20×10、20×5厘米，也有更小的，可根据需要自行设计。

宽度要求至少能点开两三个样品，每两点之间相隔至少1.5厘米，玻板长度一般要满足展开10厘米的距离。

点样的起点应距底边至少1.5厘米的距离。

2．吸附剂应用最广泛的为硅胶和氧化铝，市场上有专供薄层色谱用的吸附剂，规格分不含粘合剂的硅胶H，氧化铝H和含有粘合剂熟石膏的硅胶G，氧化铝G，如市售硅胶G含13％熟石膏，氧化铝分中性、酸性、碱性三种。

吸附剂的粒度范围最好在180－200目之间，太小了流速慢，太大则影响分离效果。

如不合要求，应过筛。

3．薄层板的涂布最简单的涂布方法是用两条比玻璃板厚0．25毫米的玻璃条或有机玻璃条（或在同样厚度的玻璃条下粘一层胶布），将玻璃板夹住，把调好的吸附剂浆液平铺在薄层板上，然后用一有机玻璃条或直尺，迅速均匀地向前推进，就象推血片一样，只要推进的速度均匀一致，即可得到薄厚均匀的薄层板，如在一块玻璃板末端再接一块相同的玻璃板，把剩余的装液接过去，可使涂层边缘整齐，厚度一致，吸附剂浆液的加水量和搅拌时间是涂布成败的关键，像12×8平方厘米的玻璃板需要2~3克硅胶G，加4~6毫升水即可，只要技术熟练即能涂成厚薄一致，光滑平整的一块薄层板。

不同性质不同批号的吸附剂，加水量和搅拌时间有时可有差异，应根据情况摸出规律。

为了达到涂布的各板厚度均匀一致，最好采用涂布器进行薄层的涂布。

为了增加薄层的牢固性及易于保存，可在涂布过程中加入某些粘合剂以增加薄层的硬度。

一般采用添加剂羧甲基纤维素钠（CMC—Na），应用方法是取CMC-Na 1克溶于100毫升水中，加热煮沸溶解，按比例与硅胶搅匀，铺板。

涂成之后先把玻板放在平面上，室内干固，再对光检查，看是不是均匀，有无气泡，平整光洁度如何，合格的上烤箱110℃加热30分钟进行活化，冷却后贮于干燥器内备用。

在进行实验时，应尽量可能采用同批号涂布活化的薄层板，以减少因活化不一致引起的Rf值发生差异，目前国内市场已有成品供应，如黄岩化学分析材料厂即有各种类型的薄层板出售。

三、薄层板的使用1．点样将样品溶于适当的溶剂中（应尽量避免有水），取微量注射器或玻璃毛细管截齐后，吸取一定量的检样，轻轻接触到薄层上，使样品自动吸到薄层上，点的直径不要超过0.3厘米，一次不能点完，待干后再点，稍有过分就会损伤板面，影响展开后的斑点形状。

每两个样点之间相距至少1.5厘米。

点样的起点距薄板底边至少1.5厘米，以免样点浸入展开溶剂中，同块薄板上各样点应保持在与底边平行的一条直线上，为控制好点样距离，应用薄层点样尺架。

2．展开根据薄层板大小，自行选用适当玻璃标本缸，长方形，如17×10×6厘米的标本缸可容纳下15×9厘米的玻璃板。

采用较大的玻璃缸和玻璃板时，在缸内沿周围缸壁衬一层预先浸有溶剂的滤纸，以便缸内展开溶剂易达到饱和，防止边缘效应（即两边缘的点走得快）和同一物质Rf值不一致现象。

一般将薄层板斜置展开容器内，密闭。

先不使溶剂浸湿薄层板，饱和10~15分钟后再进行展开，展开溶剂沿着薄层板向上移动。

对加粘合剂的涂板可以近于垂直的状态进行展开，而对未加粘合剂的薄层板则必须以倾斜状态（15度角）进行展开。

为了防止产生“边缘效应”和展开溶剂不饱和现象。

还可采用夹心式展开容器，其方法是将薄层板的左右两侧各刮去5~10毫米，垫上条状玻璃或塑料，盖一块与薄层板同样大小的玻璃，用夹子将两边夹好，插入展开溶剂中进行展开，并能取得良好效果。

3．显色薄层展开后，凉干。

如含粘合剂，即可直接喷显色剂，使之显色，有的还需经紫外线（254nm）照射后方能显色；对不含粘合剂的薄板，在喷显色剂时应尽量远离薄层板，否则会连吸附剂一起吹掉，应予以注意。

四、检样的定性定量分析1．比移值（Rf）的测定当样品的薄板一端被展开，经过毛细管作用流向另一端，样品是按一定的比例分配在固定相与流动相之间。

并沿着溶剂流动的方向移动，由于样品中各组分在两相中分配系数不同，各组分的移动速度也不同，经一定距离后使各组分彼此分离。

样品各组分移动的速率，亦即分离后在薄层板上的位置与溶剂展开前沿的距离的比值为比移植。