一、实验目的熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。

二、实验材料患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原）三、实验药品、用具2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔四、实验操作程序（一）病原菌的分离与鉴定1 ．培养基的制备（ 1 ）普通肉汤培养基：按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。

牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。

将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。

（ 2 ）普通营养琼脂培养基普通肉汤 1000ml琼脂 20g琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。

在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。

将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。

琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。

加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。

盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。

培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。

2 ．病原菌的分离与培养分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。

体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。

内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧后的解剖刀烫烧，以杀死表面的杂菌，随即在烧灼部位刺一小孔，用灭菌的接种环（待冷 2 ～ 5 秒）伸向烧灼部小洞中，用手指将接种环轻轻旋转两次，借以达到取足材料的目的。

左手持握普通琼脂平板，并靠近火焰，右手持取材后的接种环在琼脂平板上分区划线接种。

划线时接种环面与平板表面成 30 ～ 40 度的角轻轻接触，在平板表面轻快地移动，接种环不应嵌入培养基内，且不要重复，否则形成菌苔。

划线完毕，盖上皿盖，接种环灭菌后放下，并在平皿底部用记号笔注明接种材料、日期及操作者代号。

也可对实质性脏器用无菌剪刀下一小块，用镊子夹住病料使其剖面接触洁净的玻片，作多个触片，染色后在显微镜下直接镜检，能快速获得结果。

鳃部：用无菌接种环刮取鳃上的分泌物划平板。

血液及体液：用无菌注射器吸取病鱼血液和体液，滴于平板涂布；或用灭菌后的接种环挑取血液和体液后于平板上划线，分离细菌。

接种后的平板经30 ℃ 左右培养 24 ～ 72h 后，检查菌落生长情况，对菌落检查的主要内容包括：（ 1 ）大小：其大小以 mm 表示，微小菌落：针尖大，直径小于 0 . 5mm ，如支原体菌落、猪丹毒杆菌菌落；小菌落：直径在 0 . 5 ～ 1 mm 之间，如嗜血杆菌、布氏杆菌菌落；中等大小的菌落：直径在 1 ～3 mm 之间，如巴氏杆菌、沙门氏杆菌菌落；大的菌落：直径大于 3mm ，如炭疽芽孢杆菌菌落等。

（ 2 ）形态：圆形，不规则形（根状、树叶状）（ 3 ）边缘：整齐，不整齐（锯齿状、虫蚀状、卷发状）（ 4 ）表面：光滑、粘液状、粗糙、荷包蛋状、漩涡状、颗粒状（ 5 ）隆起度：隆起，轻度隆起，中央隆起，平升状、扁平状，脐状（凹陷状）（ 6 ）颜色：无色、灰白色、白色、金黄色、红色、粉红色（ 7 ）透明度：透明、半透明、不透明（ 8 ）溶血性：β－溶血（完全溶血），α－溶血（不完全溶血），不溶血根据菌落数量和特征，挑选可能的病原菌菌落进一步划线纯化 1 ～ 2 次后，将经纯化的可能病原菌用于感染试验。

3 ．病原菌的确定将从患病材料中分离的所有可能病原菌经纯化和扩大培养后分别进行人工感染实验。

目前最常用的人工感染接种方法有浸泡、口服和注射法等，究竟选用哪一种方法最合适，需要根据不同的疾病类型和可能的侵入途径而定。

如体表的病，可采用浸泡法（包括创伤浸泡）；体内的疾病，可采用口服、注射法。

由于绝大部分病原菌都是条件致病菌，因此在人工感染实验时还要注意感染菌的用量，接种量过大，即使该菌并不是引起实验材料致病的病原菌，也可能会因大量菌体裂解释放的大量内毒素而使感染生物死亡，为了量化感染菌的危害程度，可以测定感染细菌对接种动物的半数致死量（ LD 50 ），根据 LD 50 的大小来判断其致病力的强弱。

只有 LD 50 相对较低、感染引起的死亡与实验材料有相同症状、并且经回接实验还能分离到相同的细菌时，才能确定所分离的细菌为引起实验材料致病的病原。

在感染实验时，感染对象要求是没有患病史的同种生物，在感染前要经过 1 ～ 2 周的暂养，感染数量要 30 尾以上（至少要 10 尾以上）。

必要时，还要将温度控制在适合疾病爆发的水平。

感染过程中要定时投饵和换水，同时安排合适的对照组。

4 ．病原菌的鉴定分别观察病原菌的形态以及检测其各种生理生化指标，通过查阅伯杰氏手册确定病原菌的种类；也可直接用细菌鉴定仪测定病原菌的种类。

（二）疫苗制备1 ．病原菌的扩大培养与分离液体培养：按配方配制 2216E 液体培养基，将培养基用三角烧瓶分装并盖上棉塞后置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，冷却后于超净工作台内加入 1ml 左右预先制备的病原菌菌液，盖上棉塞，用摇床于28~ 30 ℃ 下震荡（约 150rpm ）培养 24~48h 。

病原菌经扩大培养后以 3000~5000rpm 离心20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸缓冲液）配制成 1% 或1 ‰左右的菌悬液。

茄子瓶扩大培养：按配方配制 2216E 琼脂培养基，于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热倒入经干热消毒的茄子瓶内（每瓶约 15ml 培养基），茄子瓶用消毒棉塞封口后平放于超净工作台台面，稍予摇动使培养基平铺于瓶壁，冷却后制成茄子瓶平板。

用无菌滴管吸取预先制备的病原菌菌液，在每个茄子瓶平板表面滴加 3~4 滴，再用经灼烧消毒并冷却的玻璃涂布器将菌液涂布均匀，28~ 30 ℃ 下培养24~48h 。

用无菌 PBS 洗脱平板表面的菌苔，洗脱液经 3000~5000rpm 离心 20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸缓冲液）配制成约 1% 或1 ‰ 的菌悬液。

2 ．灭活化学灭活：以福尔马林作为化学灭活剂。

灭活前先确定福尔马林对该病原菌的安全灭活浓度，确定方法为：取 7 支灭菌试管，分别 5ml 加入预先制备病原菌菌液，其中 6 支装有菌液的试管分别依次加入一定量的福尔马林，使福尔马林的终浓度分别为 0.1% 、 0.2% 、 0.4% 、 0.6% 、 0.8% 、 1.0% ，另 1 支试管不加入福尔马林作为对照；于 4 ℃ 下放置 24h 后，于每支试管中分别取 0.2ml 菌液于 2216E 琼脂平板上涂布，28~ 30 ℃下培养 48h ，检测各试管内细菌的存活情况，只有没有细菌生长的对应福尔马林浓度才是该病原菌的灭活安全浓度。

向第 1 步中制备的 1% 菌悬液内添加福尔马林，使福尔马林的最终浓度达到安全灭活浓度以上，于 4 ℃ 下放置 24h ，制备灭活菌液。

其他灭活方法：除化学灭活，疫苗制备时还可采用热灭活、紫外线和超声波灭活等方法。

3 ．安全性检测活性检测：取 0.2ml 灭活菌于 2216E 琼脂平板上涂布，28~ 30 ℃ 下培养 48h ，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在。

安全检测：将所制备的灭活菌液稀释成疫苗接种所用的浓度（一般为 10 8 cfu ），用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，经 20d 观察无发病或死亡才说明该灭活细菌是安全的。

4 ．效果检测抗体效价检测：用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，连续养殖 2 个月，从第 10d 开始每隔 10d 取 3 尾以上接种生物用微量血凝板法检测其平均凝集抗体效价。

抗体效价检测方法为：抽取感染动物血液并离心分离血清，用取样器吸取 0.1ml 血清加入经灭菌的 96 孔板的 A1 孔内，在 96 孔板 A 行的其他孔内加入 0.05ml 无菌 PBS ，从 A1 孔内取 0.05ml 血清加入A2 孔内，混匀后再从 A2 孔内取 0.05ml 液体加入 A3 孔内…… ，如此重复，使 96 孔板内后 1 个孔内的血清浓度均比前 1 个孔低 1 倍（倍释法），再在 96 孔板的每个孔内加入 0.05ml 菌液（活的或灭活的均可），37 ℃ 孵育过夜后观察（最好在 96 孔板下垫一张黑纸以增加反差），出现沉淀的最高血清稀释倍数即为血清中所含抗病原菌抗体的效价。

比较不同时期内抗体效价的变化情况，确定最高抗体效价值。

一般情况下，抗体效价越高，灭活细菌作为疫苗的效果就最好。

攻毒感染实验：选择无患病史的同种同龄寄主动物（水产养殖动物）作为感染对象，用注射法进行攻毒感染。

用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，连续养殖 2 个月，从第 20d 开始每隔 20d 取 10 尾以上接种生物用活的病原菌进行感染，感染方法为。