SDS－PAGE 蛋白电泳分析一、目的掌握SDS-PAGE 电泳原理与方法二、电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

三、试剂配制1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。

加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。

用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。

称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。

2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。

1.5M：Tris 碱18.15g 去离子水80ml 浓盐酸调PH 值8.8 加去离子水定容至100ml 3．1 M DTT：称取3.09 g DTT，加入到50 ml 塑料离心管内，加20 ml 的0.01 M NaOAc （pH5.2)，溶解后使用0.22 mm 滤器过滤除菌适量分成小份后，-20℃保存。

4．10% SDS: 20g SDS 溶于200ml 纯水中。

5．10% 过硫酸铵：1g 过硫酸铵溶于10ml 纯水中，现用现配。

6．2×SDS 上样缓冲液：1.0 mol/L Tris-Cl(pH6.8)10ml，10%SDS 40ml，50%甘油40ml，0.2g 溴芬蓝，定容至100ml。

7．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，3g Tris 碱和18.8g 甘氨酸，加入10ml 10%SDS，用去离子水补至100ml，配制成10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液；取50ml 10×缓冲液，稀释至500ml，配制成工作浓度1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

8．考马斯亮蓝R250 染色液：1gR250 溶于250ml 异丙醇、100ml 冰乙酸和650ml 去离子水的混合液中，过滤去除颗粒状物。

9．脱色液：乙醇/水/冰乙酸分别为50ml,850ml 和100ml。

四、实验方法1．10%分离胶的配制7ml(小板为5ml)：按附录添加适量的试剂，立即倒胶，加水封胶待凝固。

2．吸干封液的水，倒浓缩胶。

3. 5%浓缩胶的配制3ml：按附录添加适量的试剂，立即倒胶，插入梳子待凝固。

3．取下梳子，用蒸馏水冲洗梳孔，洗净其中的残余胶块，用滤纸吸干。

4．将制成的胶放入电泳槽内，倒入1×甘氨酸电泳缓冲液，观察不渗漏即可。

5．取10μl 样品，加入等体积的2×SDS 上样缓冲液，样品与蛋白质Maker 100℃保温5min。

6．分别取10μl 上样，110V 恒压电泳2～3 小时。

7．将胶剥下至一平皿中，加入考马斯亮蓝染色1～2 小时，回收染色液后，倒入脱色液脱色过夜，其间换脱色液1～2 次。

五、实验结果观察电泳结果，分析蛋白大小，结合实验一，通过蛋白条带的变化分析细胞破碎效果六、见附录1：分离胶和浓缩胶配方表常见问题分析：1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。

在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。

由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。

当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。

一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。

2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。

100ul 样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。

建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。

忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。

一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

5.“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

7. 为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

8. 为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

9. 什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。

但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。

主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

11. 为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。

比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。

主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。

包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：电泳槽正确装配即可。

13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。

前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30MIN-1H内凝。

如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。

APS 应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。

如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

15. 电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。