XXXXXXXXXXXXXXXXXX
实施部门
品质部
编制
日期
工序名称
细菌内毒素检验
审核
日期
批准
日期
序号
作业内容及作业要项
参考图
3.6
4
表2凝胶限量实验溶液的制备
编号
内毒素浓度/配制内毒素的溶液
平行管数
A
无/供试品溶液
2
B
2λ/供试品溶液
2
C
2λ/检验用水
2
D
无/检验用水
2
注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。
按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应未检
辅助材料
鲎试剂标准品检查用水9g/L的氯化钠溶液
设备及工艺装备
Ph计、漩涡混合器、试管恒温仪、生化培养箱，锥形瓶，直吸管
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文件编号：3技.PZ.09-04天津市XXXXXXXX有限公司总页号：13
细菌内毒素检验标准书
内容
供试液的制备
检验液的制备：取三套样品置于洁净的锥形瓶中（锥形瓶需经过干热灭菌），在向瓶中加入一定量的9g/L的氯化钠溶液（样品表面积与溶液的体积比为10 c㎡：1ml），振摇数次后置于37±1℃的恒温生化培养箱中不少于1h，最后收集全部液体冷却至室温作为检验液。
空白液的制备：取同体积水，不装样品同法制备空白对照液。
设备及工艺装备
Ph计、漩涡混合器、试管恒温仪、生化培养箱，锥形瓶，直吸管
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文件编号：3技.PZ.09-04天津市XXXXXXXX有限公司总页号：11
细菌内毒素检验标准书
共5页第2页
产品名称
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
实施部门
品质部
编制
日期
工序名称
当Ea在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5 Ea～2Ea（包括0.5 Ea和2Ea）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对实验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺或环境中发生了任何有可能影响实验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
稀释倍数
所含内毒素的浓度
平行管数
A
无/供试品溶液
———
——
——
2
B
2λ/供试品溶液
供试品溶液
1、2、4、8
2λ、1λ、0.5λ、0.25λ
4、4、4、4、
C
2λ/检验用水
检查用水
1、2、4、8
2λ、1λ、0.5λ、0.25λ
4、4、4、4、
D
无/检验用水
———
——
——
2
注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。
a根据鲎试剂灵敏度的表示值，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在漩涡混合器混匀30秒种，取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原装安瓶18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
细菌内毒素检验标准书
共5页第1页
产品名称
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
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工序名称
细菌内毒素检验
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日期
序号
作业内容及作业要项
参考图
1.
2.
3.
3.1
3.2
目的
制定本标准书，用来规范细菌内毒素检测的操作流程，以确保产品内毒素检测的正确。
范围
适用于本公司产品的细菌内毒素检测。
b将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管形
成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性；未形
辅助材料
鲎试剂标准品检查用水9g/L的氯化钠溶液
设备及工艺装备
Ph计、漩涡混合器、试管恒温仪、生化培养箱，锥形瓶，直吸管
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产品检验
辅助材b v h料
鲎试剂标准品检查用水9g/L的氯化钠溶液
设备及工艺装备
Ph计、漩涡混合器、试管恒温仪、生化培养箱，锥形瓶，直吸管
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文件编号：3技.PZ.09-04天津市XXXXXXXXX有限公司总页号：14
细菌内毒素检验标准书
共5页第5页
产品名称
λc=lg-1（ΣX/4）式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验
表1凝胶法干扰实验溶液的制备
编号
配制内毒素的溶液浓度
稀释用液
细菌内毒素检验标准书
共5页第3页
产品名称
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工序名称
细菌内毒素检验
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序号
作业内容及作业要项
参考图
3.3
成凝胶或形成凝胶不坚实、变形并从管壁脱落者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，实验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）
细菌内毒素检验
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日期
批准
日期
序号
作业内容及作业要项
参考图
检验方法：凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验：在本检查规定的条件下，使鲎试剂生产凝集内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或实验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
共5页第4页
产品名称
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
实施部门
品质部
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日期
工序名称
细菌内毒素检验
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日期
批准
日期
序号
作业内容及作业要项
参考图
3.4
3.5
出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核实验项下操作。只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围时，实验方有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Ea和Et）。
Ea=lg-1（ΣXa/4）Et=lg-1（ΣXt/4）
式中Xa、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（lg）。
当Ea在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5 Ea～2Ea（包括0.5 Ea和2Ea）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对实验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
一般要求供试液的PH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需要调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸，碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜缓冲液调节PH值。酸或碱溶液必须用细菌内毒素检查用水在已除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经验证不含内毒素和干扰因子。
检测
辅助材料
鲎试剂标准品检查用水9g/L的氯化钠溶液
结果判断：保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照液B的平行管均为阳性，阳性对照液C的平行管均为阳性，实验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定，若溶液A的两个平行管均为阳性，判供试品符不合规定。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定，否则判供试品符不合规定。
记录原始数据，填写检验报告。
辅助材料
鲎试剂标准品检查用水9g/L的氯化钠溶液
设备及工艺装备
Ph计、漩涡混合器、试管恒温仪、生化培养箱，锥形瓶，直吸管
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处数
更改文件号
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处数
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签字
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文件编号：3技.PZ.09-04天津市XXXXXXXXXX有限公司总页号：15