? 2．高质量大分子量基因组 DNA 的提取践表明，提取的 基因组 DNA 分子量越大，所得到到的 28SrRNA条带的亮度约为 18SrRNA条 带亮度的两倍，说明 RNA样品完整，降解不多，如果两条带 的亮度反过来，说明部分 28SrRNA已降解；如无清晰条带， 表明样品己严重降解。
mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。
2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生 完整的cDNA)
体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有 菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因。外源DNA片断、载体、宿主
? 构建基因的基本程序：（1）提取研究对象基因组 DNA,制备合适大小的 DNA 片断，或提取组织或器官的 mRNA并反转录成 cDNA，
2）表达量的差异决定构建 cDNA要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总 mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300 个拷贝，占总 mRNA的49% 低丰度mRNA ：1-15个拷贝，占总 m数目，
Clark和Carbon公式：
N=ln（1-p）段的大小和基因组 DNA 大小
的比值
例：哺乳动物基因组：3×109 Kb p：=99%
一般覆盖倍数达到是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个 YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交
显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上
则可将Spel酶切的 基因组DNA中或这一时期的特殊组织。
根 叶 花 花药 茎 穗下节cDNA 第一链的合成、c的基因组DNA或cDNA片段取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
并导入宿主中繁殖。
插
1）mRNA的完整性及mRNA的富集
通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的 完整性，间接判断mRNA的完整性。
（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA，
（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌，
（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因组DNA基因cDNA
基因组与cDNA最大的区别在于cDNA具 有时空特异均插入片段大小20kb
f= 20Kb/3×109 Kb
N=ln（1-p）/ln（1-f） =690构建程序包含 5 个部分：
? ① 载体的制备； ? ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight
DNA, HMW DNA ）的提取； ? ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（ PFGE size
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱselection）； ? ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ? ⑤ 重组克隆的挑取高；二是去磷酸化好。
? 寻找最适的载体与基因组之间的 比例。 ? 首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价
高且质量稳定的包装蛋白， ? 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入
片段的 DNA合成
氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链 第一链 cDNA 的 3'-末端就会形成一个发夹环 合成第二链 cDNA S1 核酸酶消化连接处
自身引导法合成 cDNA第二链
常用方法