Hm
2 Cm d p
Dm
u
式中Cm是常数(与k有关)，Dm 为组
分分子在流动相中的扩散系数。
H sm
2 Csm d p
Dm
u 式中Csm为一常数；
综上所述，由柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度 的变化可归纳为：
将上式简化：
H= A + B/u + Cu
可见，减小填料的孔径和粒度，采用低粘度
及低流速流动相，适当提高温度等方法都可提高
紫外检测器的缺点：不适用于紫外光完全不吸
收的试样，溶剂的选用也受到一定的限制。
光电二极管阵列(photo-diode array detector)检测器是紫外检测器的重要进展。 1024个二极管阵列，各检测特定波长，通过计 算机快速处理，形成三维立体谱图，如图所示。
(2)差示折光检测器：
该检测器是继UV检测器之后，第二种广泛使
到排阻，就直接通过柱子首先在色谱图
上出现；另外一些小分子可以进入胶孔
并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保
留值最大，在色谱图上最后出现。
排阻色谱法中，载液
分子通常都很小，它们一
般最后被洗脱(tM最大)，
结果是：整个试样都在tM (死时间)以前洗脱。 由于排阻色谱法的 分离机理与其他色谱法 不同，具有几个突出的 特点：
而HPLC中，当固定相选定时，流动相的种类 、配比能显著地影响分离效果。选择流动相时应 注意以下几方面因素： (1)纯度 如溶剂不纯，则长期积累杂质会导致检测器 噪声增加，同时也影响收集的馏分纯度。
(2)避免使用引起柱效损失或保留特性变化的溶
剂。
(3)对试样要有适宜的溶解度，否则在柱头易产 生沉淀。 (4)考虑到泵压，流动相的粘度小些为好。 (5)应与检测器相匹配，如紫外光检测器，就不 能使用对紫外光吸收的溶剂。
排阻色谱所用的溶剂必须与凝胶本身非常 相近，以润湿凝胶并防止吸附作用。对分离大分 子化合物，易采用粘度小的溶剂作流动相如四氢 呋喃、甲苯等。对分离生物物质，主要采用水、 缓冲盐溶液等。 §3-7 HPLC分离类型的选择
应用HPLC对试样进行分离、分析方法的选择， 应考虑几种因素，包括：试样性质(分子量、结 构、极性、溶解度等)、HPLC分离方法类型的特 点及应用范围等。
正相色谱中，底剂采用低极性溶剂如正己
烷、苯、氯仿等；而洗脱剂则根据试样的性质
选取极性较强的针对性溶剂如醚、酯、酮、醇
和酸等。
反相色谱中，底剂一般采用水，洗脱剂常 采用有机溶剂如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。 而离子交换色谱法主要在含水介质中进行 ，组分的保留值可通过调节流动相中的离子强 度和pH来控制。
(steric exclusion chromatograph)
空间排阻色谱法以凝胶(gel)为固定相。分 离机理与其它色谱法完全不同。 该方法分离的机理类似分子筛的作用，但孔 径比分子筛要大，为数纳米到数百纳米。溶质在 两相间的分离不是由于相互作用力的不同，而是 按分子大小进行分离。
试样中的大分子不能进入胶孔而受
该方法的几个突出特点： (1)高压：
液相色谱以液体作为流动相(称为载液)，液
体流经色谱柱受到的阻力较大，为使载液迅
速通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般
可达到150~300kg/cm2。
(2)快速： 由于使用了高压，HPLC所需的时间较之经典 液相色谱短得多，如分离苯的羟基化合物七 个组分，只需1分钟；对氨基酸的分离，
可达10-11克；所需试样为微升级。 HPLC与GC相比较的突出优点： • 用GC法分析样品须先气化，目前已知的有机
物中，能直接采用GC法进行分析的仅占20%。
而HPLC法则不受此限制，尤其适合于分析生
物、医学方面的大分子及离子型化合物。
• HPLC方法中，有两个相与样品分子相互作用 ，而GC方法中一般认为只有一个相与样品分 子相互作用。所以HPLC的选择性大大提高。
固定相传质阻力Hs—主要发生在液液分配色谱
中，类似于气液色谱中的液相传质阻力项。
Hs
Cs d 2 f Ds
u
式中Cs 为常数(与k有关)；Ds为组
分分子在固定液内的扩散系数；
由上式可见，Hs与GC中的CL含义是一致的。 流动相传质阻力—HPLC中该项有两种形式，分为 分别用Hm和Hsm表示。
在流动的流动相中和滞留的流动相中的传质阻力，
由贮液瓶、高压泵(梯度洗提装置)、进样器、 色谱柱(恒温器)、检测器和记录仪组成。
主要部件简述： 1.高压泵 其作用是输送载液(流动相)。由于色谱柱很细 (1~6mm)，填充剂粒度小(几十微米)，因此要 达到快速高效的分离效果，要求压力为150~ 200kg/cm2。 2.梯度洗提装置 又称梯度洗脱(gradient elution)和气相色谱 法中的程序升温类似，对复杂混合物的分离带 来方便。
用的液相色谱检测器。图示： 光源1射出光线由 透镜2聚焦,透过遮 光板4的狭缝,经反
射镜5反射后,由透
镜6汇聚两次,穿过
工作池7和参比池8
偏转式差示折光检测器光路图
被平面反射镜9反射出来，成像于棱镜11的棱口
上，光束均匀分为两束，到达对称的光电管12上。 如果工作池和参比池皆通过纯流动相，光 束无偏转，左右两个光电管的信号相等；
经典液相色谱需用20小时才能分离出20种氨基
酸，而HPLC只需1小时即可完成。载液在色谱柱
内的流速可达1~10mL∙min-1。 (3)高效：
气相色谱的柱效（n值）约为2000塔板/m，而
高效液相色谱约为5000塔板/m以上；一根高效液
相色谱柱可同时分离多达100种以上的组分。
(4)高灵敏度： 由于在HPLC中使用高灵敏度的检测器，如紫 外检测器的最小检测量可达10-9g，荧光检测器
效以理论塔板数计大约7000~10000。其发展趋势
是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
5.检测器 常用的检测器： (1)紫外光度检测器(UV)： 它的作用原理是基于被分析试样对特定波长 紫外光的选择性吸收。池内样品浓度与吸收的 光强度服从比耳定律。P.304. 最小检测量为10-9g∙mL-1，对流量和温度的波 动不敏感，可用于梯度洗脱。
如果分子量较低，挥发性较高且热稳定的
试样，适用于GC法进行测定。HPLC法适用于相
对分子质量为200到2000的试样测定，大于2000
的宜用空间排阻色谱。
另外，了解试样在多种溶剂中的溶解情况，
有利于分离类型的选择。 如溶解于水的试样可采用液液色谱法；溶解 于酸或碱性水溶液的，则表示试样为离子型化 合物，可采用离子交换色谱法、离子对色谱法 等。
3.离子交换色谱法
(ion-exchange chromatography) 该方法是基于离子交换树脂上可电离的离
子与流动相中携带相同电荷的组分离子进行可
逆交换，依据这些离子对交换剂的不同亲和力
而进行分离。
凡是在溶剂中能电离的物质通常都可用离子交 换色谱法进行分析。
阳离子交换：
M ( Na O3 S —树脂) ( M O S — 树脂 ) + Na 3
所谓梯度洗提，指载液中含有两种或两种以
上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序
连续改变载液中各溶剂的配比。由此通过改变
载液的极性来达到分离组分，提高分离效果。 3.进样装置
因为流路中为高压力工作状态，通常使用耐高
压的六通阀进样装置。
4.色谱柱 常用的标准柱型是内径4.6或3.9mm，长度为
15~30cm的直形不锈钢管。填料粒度5~10m，柱
(1)试样峰全部在溶剂的保留时间前出峰，它们
在柱内的停留时间短，故柱内产生的峰扩展
比其他方法小得多。
(2)固定相和流动相的选择简便。 (3)适用于分离相对分子质量差别在10%以上的
分子。
§3-6 HPLC的流动相
GC中可供选择的载气只有三四种，它们的
性质差异不大。要提高柱的选择性，主要是改
变固定相的性质。
如果工作池中有试样通过，由于折射率改变， 左右两个光电管接受的光能量不等，其差值正比 于试样的浓度。
造成光束偏转，从而使到达棱镜的光束偏离棱口，
每种物质都有各自不同的折射率，因此都可
用差示折光检测器进行检测，所以是一种通用型
的浓度检测器。灵敏度为10-7g∙mL-1。 缺点：对温度变化很敏感，此检测器不能 用于梯度洗提。 §3-3 HPLC的理论基础简述 高效液相色谱法的理论基础基本与气相色 谱法相同，但有其不同之处。两者的主要区别 在于流动相的不同。
载液中
载液中
阴离子交换：
- X - (Cl R4 N —树脂) ( X R N — 树脂 ) + Cl 4
载液中
载液中
离子交换色谱法主要用来分离离子或可离 解的化合物，20世纪60年代前后，已成功分离 了氨基酸、核酸、蛋白质等，在生物化学领域 得到了广泛的应用。
4.空间排阻色谱法
• HPLC方法中，因为在常温下进行分析，因此 固定相的选择比GC多；另一方面可提高色谱 的分离效率。 • HPLC方法中，可使用灵敏度较高的光度检测 器，而在GC方法中则无法使用。 • HPLC方法中，样品可以回收，而GC方法中样品 回Байду номын сангаас则较困难。 §10-2 HPLC色谱仪
高效液相色谱仪的结构如下：
根据分离机制的不同，HPLC可分为下述几种主
要类型：
液-液色谱法、液-固色谱法、离子交换色谱法、
离子对色谱法、离子色谱法和空间排阻色谱法
等。 1.液-液分配色谱法 (L-L partition chromatograph) 流动相和固定相都是液体，其分离原理为试 样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存 在差异。当浓度分配达到平衡时，应服从于下 Cs VM 式： K k k CM Vs