操作标准
目得:为了使BＰG3００层析柱装柱过程可重复,并能够得到较好得柱效,故建立此操作规范。
范围:配合ÄKTA prｏcｅsｓ系统进行有效得蛋白质纯化操作。
责任人:层析工序操作人员
标准操作程序:
1基本术语概念
填料因子(PackｉｎｇFａｃtor, PＦ):指在在装柱过程中,用低流速(如６0ｃ
m/h)对填料进行沉降压缩得到得调料高度与最后装柱完成时填料高度(柱高)得
比值,
GＥHC生产得各种常见填料得PF参见《GEＨC ＡxiＣhroｍ300－10０0columns UseｒＭanuａl 28-95６２—89 Ｅｄiｔiｏn AＡ》;
线性流速(liｎeａr flow ratｅ):单位时间内液体流经得直线距离,常用cm／h
表示;
体积流速(volume floｗratｅ):单位时间内液体流经得空间容积,常用ml/mｉ
ｎ表示;
换算:
２准备工作
2.１检查层析柱得完整性,所带配件,就是否水平(用水平仪矫正),就是否清洁(如有污染应进行清洗)、
2、２确定所用填料及其特性、浓度等
以DＥAE ＳｅpｈaroｓｅFast Flｏw填料为例,其填料因子(PF)为1.１５,新填
料(slｕｒｒy)浓度为75％(保存于2０%乙醇中),耐压3bａｒ。
2。
3 确定放大后得工艺参数
以ＸX生化制药股份有限公司得放大工艺为例,
中试工艺参数:
柱高h＝10ｃm;体积流速v1=3mｌ/min;柱内径d=１、６cm、
即,线性流速v ２=v1/s 柱=3/(3、14×0。
82) cm/mi ｎ=1.５ cm ／min;
样品与填料接触时间t ＝h ／v2=１０/1、5min ＝6。
67mi ｎ;
在工艺得线性放大中h 、ｖ2与t 均不变,则可保证样品出峰得位置(洗脱时间)与形状不变、
使用ＢP Ｇ３００层析柱进行放大得工艺参数:
装柱体积V 柱= S 柱h=3。
1４×1、52×１L=7Ｌ;
装柱需要sl ｕr ｒｙ体积V ｓｌurry =Ｖ柱×PF/C sl ｕr ｒy
以ＤE ＡE Sepharo ｓe Fast F ｌow 为填料,
则,V slur ｒｙ＝7×1。
15/0、７５Ｌ＝10。
7３L;
装入柱中得slur ｒy 高度Ｌsl ｕr ｒｙ=V slurry /S 柱＝１0、73/(3。
1４×1。
52)dm=1.５2
ｄm=15。
2cm 。
３管路安装
３、１ 层析柱管道与配件安装
３。
1、1卸下柱子顶部与底部得盲堵垫圈,旋松密封调节器,用纯水或2０%乙醇充分浸润柱内壁与柱头O 型圈;
３.1。
2 用扳手对称卸下支持杆连接到法兰得螺丝,并通过旋转高度调节手柄将柱头旋至最高处,在柱头顶部依次安装压力表与四路二通阀,在柱底安装四路二通阀;
3。
1、３在顶部四路二通阀上横向连接一根细管,另一端连至ÄＫＴA pro ｃe ｓs 上端连接口C ＯLUMN TOP,同时从柱底四路二通阀横向接出一根细管至ÄＫTA pr ｏｃe ｓs 得下端连接口CO ＬU ＭＮ ＢＯTT ＯM 、
图1、ＢP Ｇ３０0层析柱安装示意图
３。
2层析柱下端筛网排气泡
3.2.１连接两根足够长得细管到ÄK ＴA ｐr ｏcess 进样泵得A1与Ｂ1进口,两管另一端均放入纯水中;
3。
2、2从A1泵入纯水:打开UNI ＣORN 软件,在ｓys ｔｅm co ｎtrol 窗口点击man ｕal →va ｌves →ＩnletA,选择inletA1,ins ｅｒｔ;I ｎletB,选择clos ｅd,i ｎ
sert;Column,选择uｐflｏｗ,iｎｓeｒt;Ｐump→Ｆloｗ,设定流速60L/h,点击ｅx ｅcｕte运行程序充水至BPG柱中2-3cm左右,ｐause,清除下端筛网中得空气,用注射器吸出筛网中残留得气泡。
4装填料
4、1准备填料
所用填料为DＥＡＥ Sephaｒose Fast Ｆｌow ,装置得就是保存于２０％乙醇中得新slurry;
４、2卸下柱头,用搅拌棍引流加入混匀得sｌurｒy至15、2cｍ处,再加入纯水至40cm左右,充分搅拌混匀,同时避免挤压筛网与柱壁,静置使填料界面至少低于38ｃm;
4、3在system control窗口点击manual→vａlvｅs→InlｅtA,选择iｎlｅｔＡ1,i ｎsｅrｔ;ＩnlｅｔＢ,选择ｃlosｅｄ,iｎｓert;Ｃoｌumn,选择dｏwｎflow,insert;Pump→Flow,设定流速60L／h,点击exeｃute运行程序将柱头上端筛网充满水以除去气泡,再装上柱头,用密封调节器固定柱头,拧紧螺丝;
４、4在sｙｓtem cｏntrol窗口点击manｕａl→Pumｐ→Flow,设定流速为4２L/ｈ(6０cm/h),进行填料得沉降,待填料高度降至14cm左右,将密封调节器旋至全松,将柱头快速调至距离填料3—4cｍ处,将密封调节器旋至半松,将柱头快速调至滤网距离填料1-2ｃm,旋紧密封调节器,再设定高流速(如１50Ｌ／ｈ),继续压缩填料,最后再调节柱头至１0cｍ、整个过程一直有流速,泵速不能停。
5 柱效测定
图2、柱效测定示意图
5.１平衡
将Ａ1接口细管放入0。
4M NａＣl溶液中,将柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态,在ｓystem ｃｏntｒｏl窗口点击mａnual→valves→InletA,选择inletＡ１,ｉnｓerｔ;InｌetB,选择clｏseｄ,insｅrt;Colｕmn,选择dowｎflow,ｉns ｅｒt;Pumｐ→Floｗ,再设定高流速(如１５0L/h),点击ｅｘｅcute运行,排气泡,再将阀调至管路与柱头相连状态,平衡3—5个柱体积至电导曲线稳定,点击ＥND;
5。
2上样
5、２、1将B1接口细管放入2M NaCl溶液,柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态,在sｙsｔem contrｏl窗口点击manuaｌ→valｖes→InlｅtＡ,选择Ｃloseｄ,inserｔ;InｌｅｔB,选择InｌeｔB1,ｉnsｅrt;Cｏｌｕｍn,选择dowｎflｏｗ,insｅrt;Pｕmp→Fｌｏw,设定高流速(150L/h)点击ｅxｅcute运行,排气泡,pause;
5、２。
２在syｓtem contrｏｌ窗口点击manual→Ｏtｈer→End_Ｔimer,选择Ａcc、 Volumn, Timeout 设上样量为70mL(1％柱体积);Ｐump→Ｆlow,设定上样流速60Ｌ／h,点击ｅxecｕte得同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连,完成上样;
5。
3 洗脱
5.3。
1将柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态,在systeｍcontrol窗口点击ｍanual→ｖａlｖes→InｌetA,选择ｉnletA1,inserｔ;InｌetB,选择cｌosed,ｉnｓert;Ｃｏlumn,选择downfｌow,insｅrt;Pｕｍｐ→Fｌow,设定高流速(150L／h)点击ｅxeｃｕte运行,排气泡,同时将管路充满0。
4M ＮaCｌ溶液,调流速至２1L/h(30ｃm/h);
５.3、2 待流速稳定后,在ｓystem control窗口点击mａnual→ｖalvｅs→Ｉnjectｉon Mark,ｉｎsｅrt,点击exeｃute得同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连,开始洗脱,在一个柱体积左右,电导检测下将产生目得峰。
5.４测柱效
在Evaluａｔion窗口中,选择实验保存得结果,在结果图中点击鼠标右键,选择Prｏｐerties,点击Clear,并选中Cond_102,点击OK。
回到Evaｌuaｔion窗口,选择积分按钮,在弹出窗口中,选择Cond_１０2,peａk wiｎｄow中调整积分得范围,并在Rｅｊｅct Peaks中,填Peａk ｍusｔ be one of1lａｒgｅst;确定后,在积分结果窗口,点击右键,选择Ｐroperｔies,在pｅaｋtable选项中,勾选Plａte Heｉght(HＥTP)与Aｓymｍetry。
确定后即可计算得到计算理论塔板高度HE ＴP与对称因子Ａs。
1 Whｅn calcｕlaｔing the amounｔof ｍｅdia ｔo be paｃkeｄ usｅthe p ｒessｉoｎＦａctor 1。
1 iｎsｔead of the Pacｋiｎg Factｏｒ above whicｈｉs useｄ durinｇｐacｋing。